Histology · 0.4
組織学的手法・顕微鏡：顕微鏡法
Techniques & microscopy — Microscopy
🧠 顕微鏡法は「何で見るか（光か電子か）」と「どう見るか（明視野brightfield明視野（brightfield）brightfield（明視野）か蛍光か位相差phase difference位相差（phase difference）phase difference（位相差）か）」の掛け合わせとして整理する。 解像度resolution解像度（resolution）resolution（解像度）を決めるのは光源の波長で、電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線）は可視光よりずっと波長が短いため電子顕微鏡electron microscopy, EM電子顕微鏡（electron microscopy, EM）electron microscopy, EM（電子顕微鏡）（EM）は光学顕微鏡light microscopy, LM光学顕微鏡（light microscopy, LM）light microscopy, LM（光学顕微鏡）（LM）よりはるかに高い分解能をもつ——この一点さえ押さえれば、なぜ細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）の詳細観察にEMが必須なのかが導ける。
光学顕微鏡と分解能
顕微鏡の性能を決める最も重要な指標は分解能＝2点を別々のものとして識別できる最小距離であり、これは主に使用する光（または電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線））の波長によって決まる。
| 顕微鏡の種類 | 光源 | おおよその分解能 | 主な用途 |
|---|---|---|---|
| 明視野顕微鏡bright-field microscope明視野顕微鏡（bright-field microscope）bright-field microscope（明視野顕微鏡） | 可視光 | 〜0.2μm | H&E標本など一般組織標本の観察 |
| 位相差顕微鏡phase-contrast microscope位相差顕微鏡（phase-contrast microscope）phase-contrast microscope（位相差顕微鏡） | 可視光（位相差phase difference位相差（phase difference）phase difference（位相差）を利用） | 〜0.2μm | 無染色の生細胞・培養細胞cultured cell培養細胞（cultured cell）cultured cell（培養細胞）の観察 |
| 蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡） | 可視光（励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）） | 〜0.2μm | 免疫蛍光法immunofluorescence assay (IFA)免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)）immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法）（00-3-immunolabeling-molecular）の観察 |
| 共焦点レーザー顕微鏡confocal laser scanning microscope共焦点レーザー顕微鏡（confocal laser scanning microscope）confocal laser scanning microscope（共焦点レーザー顕微鏡） | レーザー光 | 〜0.2μm（Z軸分解能に優れる） | 光学的切片optical section光学的切片（optical section）optical section（光学的切片）化による3D再構築remodel再構築（remodel）remodel（再構築） |
| 電子顕微鏡electron microscopy, EM電子顕微鏡（electron microscopy, EM）electron microscopy, EM（電子顕微鏡） | 電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線） | 〜0.2nm（LMの約1000倍） | 細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）の微細構造観察 |
flowchart TD
A["分解能を決めるもの＝光源の波長"]
A --> B["可視光（波長が長い）→ LM系：分解能 約0.2μm"]
A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='electron beam'>電子線</span>（波長が極めて短い）→ EM：分解能 約0.2nm"]💡 「なぜ光学顕微鏡light microscopy, LM光学顕微鏡（light microscopy, LM）light microscopy, LM（光学顕微鏡）ではリボソームや膜の詳細が見えないのか」という疑問への答えは、光の波長そのものがそれらの構造よりも大きいから、という一点に尽きる。電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線）は波長が桁違いに短いため、はじめて細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）の内部構造（01-2-membranous-organelles）を「見る」ことができる。
電子顕微鏡
電子顕微鏡electron microscopy, EM電子顕微鏡（electron microscopy, EM）electron microscopy, EM（電子顕微鏡）には大きく2種類があり、観察したい情報（内部構造か表面形態か）によって使い分ける。
| 種類 | 観察対象 | 得られる情報 |
|---|---|---|
| 透過型電子顕微鏡transmission electron microscope, TEM透過型電子顕微鏡（transmission electron microscope, TEM）transmission electron microscope, TEM（透過型電子顕微鏡） | 極薄切sectioning薄切（sectioning）sectioning（薄切）片（超薄切sectioning薄切（sectioning）sectioning（薄切）片, ultrathin section）を電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線）が透過 | 細胞内部の微細構造（膜系・細胞骨格など） |
| 走査型電子顕微鏡scanning electron microscope, SEM走査型電子顕微鏡（scanning electron microscope, SEM）scanning electron microscope, SEM（走査型電子顕微鏡） | 試料表面を電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線）で走査scanning走査（scanning）scanning（走査） | 立体的な表面形態（三次tertiary三次（tertiary）tertiary（三次）元的な凹凸） |
⚠️ EM標本は通常のパラフィンparaffinパラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン）法（00-1-tissue-preparation）よりはるかに厳密な固定（グルタルアルデヒドglutaraldehydeグルタルアルデヒド（glutaraldehyde）glutaraldehyde（グルタルアルデヒド）固定など）と、樹脂包埋embedding包埋（embedding）embedding（包埋）・極薄切sectioning薄切（sectioning）sectioning（薄切）片化を必要とする——H&E用の固定条件をそのままEM観察に流用することはできない点に注意。
標識との組み合わせ
蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）・共焦点顕微鏡confocal microscopy共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡）は免疫蛍光法immunofluorescence assay (IFA)免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)）immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法）（00-3-immunolabeling-molecular）と組み合わせることで、特定分子の局在を細胞内・組織内で高い空間分解能spatial resolution空間分解能（spatial resolution）spatial resolution（空間分解能）で可視化できる。共焦点顕微鏡confocal microscopy共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡）は焦点面以外からの光をピンホールで除去することで光学的切片optical section光学的切片（optical section）optical section（光学的切片）を得られるため、厚みのある試料でも鮮明な像が得られ、複数の光学切片optical section光学切片（optical section）optical section（光学切片）を重ねて三次tertiary三次（tertiary）tertiary（三次）元再構築remodel再構築（remodel）remodel（再構築）することも可能である。
まとめ
- 顕微鏡の分解能は主に光源（光か電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線）か）の波長によって決まり、電子線electron beam電子線（electron beam）electron beam（電子線）は可視光よりはるかに波長が短いためEMはLMよりずっと高分解能high resolution, HR高分解能（high resolution, HR）high resolution, HR（高分解能）。
- LM系には明視野brightfield明視野（brightfield）brightfield（明視野）・位相差phase difference位相差（phase difference）phase difference（位相差）・蛍光・共焦点顕微鏡confocal microscopy共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡）があり、目的（染色標本か生細胞か標識分子marker molecule標識分子（marker molecule）marker molecule（標識分子）の局在か）に応じて使い分ける。
- EMにはTEM（内部微細構造）とSEM（表面の立体形態）があり、専用の固定・包埋embedding包埋（embedding）embedding（包埋）法が必要。
- 共焦点顕微鏡confocal microscopy共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡）は光学的切片optical section光学的切片（optical section）optical section（光学的切片）化により3D再構築remodel再構築（remodel）remodel（再構築）が可能で、免疫蛍光法immunofluorescence assay (IFA)免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)）immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法）との相性がよい。