酵素速度論：トリプシンの速度論的パラメータの決定

🧠 実習では「発色性合成基質 synthetic substrate 合成基質（synthetic substrate） synthetic substrate（合成基質） BAPNAを切らせ、遊離するp-ニトロアニリン p-nitroaniline p-ニトロアニリン（p-nitroaniline） p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） の吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） 増加＝反応速度 reaction rate反応速度（reaction rate） reaction rate（反応速度）」としてトリプシン trypsin トリプシン（trypsin） trypsin（トリプシン） のVmax・Kmを測る、と読む。 複数の基質濃度 substrate levels 基質濃度（substrate levels） substrate levels（基質濃度） で初速度 initial velocity 初速度（initial velocity） initial velocity（初速度） を測り、Beer–Lambert則で濃度に換算して、ミカエリス・メンテン式へ非線形 non-linear 非線形（non-linear） non-linear（非線形） 回帰する。¹²

トリプシンの性質

トリプシンtrypsin トリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン） はセリンプロテアーゼserine proteaseセリンプロテアーゼ（serine protease）serine protease（セリンプロテアーゼ）で、膵臓から不活性な前駆体トリプシノーゲン trypsinogen トリプシノーゲン（trypsinogen） trypsinogen（トリプシノーゲン） として分泌され、小腸内腔で活性化されて働く（→限定分解limited proteolysis 限定分解（limited proteolysis）limited proteolysis（限定分解） による活性化）。生理的基質physiological substrate 生理的基質（physiological substrate）physiological substrate（生理的基質） ではアルギニンarginine (Arg) アルギニン（arginine (Arg)）arginine (Arg)（アルギニン） またはリジン残基のC末側のペプチド結合を主に切断する。人工基質では対応するエステル結合 ester bond エステル結合（ester bond） ester bond（エステル結合） やアミド結合 amide bond アミド結合（amide bond） amide bond（アミド結合） も加水分解でき、この性質を酵素活性測定 enzyme activity assay 酵素活性測定（enzyme activity assay） enzyme activity assay（酵素活性測定） に利用する。³

発色基質BAPNAとアミド分解活性

合成基質synthetic substrate合成基質（synthetic substrate）synthetic substrate（合成基質） BAPNA（Nα-ベンゾイル-L-アルギニン L-arginine L-アルギニン（L-arginine） L-arginine（L-アルギニン） -p-ニトロアニリド） を用いる。アルギニンarginine (Arg) アルギニン（arginine (Arg)）arginine (Arg)（アルギニン） のカルボキシ基とp-ニトロアニリン p-nitroaniline p-ニトロアニリン（p-nitroaniline） p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） がアミド結合 amide bond アミド結合（amide bond） amide bond（アミド結合） でつながった分子で、トリプシンtrypsin トリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン） がArgの後ろのこの結合を切ると p-ニトロアニリンp-nitroanilinep-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） が遊離する。

flowchart TD
  BAPNA["BAPNA<br>Nα-ベンゾイル-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='L-arginine'>L-アルギニン</span>-p-ニトロアニリド<br>無色"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='trypsin'>トリプシン</span><br>H₂O<br>Arg の後ろの<span class='jp-term jp-term-diagram' title='amide bond'>アミド結合</span>を加水分解"| PNA["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='p-nitroaniline'>p-ニトロアニリン</span><br>黄色・405 nm 付近で吸収"]
  BAPNA -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='trypsin'>トリプシン</span><br>H₂O"| BZARG["Nα-ベンゾイル-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='L-arginine'>L-アルギニン</span><br>無色"]

💡 吸光度absorbance 吸光度（absorbance）absorbance（吸光度） の増加速度がそのまま初速度 initial velocity初速度（initial velocity） initial velocity（初速度）。 基質は吸収せず生成物だけが黄色く吸収するので、p-ニトロアニリンp-nitroaniline p-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） の遊離量＝切断されたBAPNA量となり、405 nm吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） の時間変化が反応速度 reaction rate 反応速度（reaction rate） reaction rate（反応速度） vに比例する。Beer–Lambert則（A = ε·c·l、l=1 cm）で吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） をp-ニトロアニリン p-nitroaniline p-ニトロアニリン（p-nitroaniline） p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） 濃度に換算する。

実験条件と手順

1. 5通りの基質濃度 substrate levels 基質濃度（substrate levels） substrate levels（基質濃度） [S₀]を用意する（Km推定値≈2 mM、推奨範囲 0.1×Km < [S₀] < 20×Km、上昇域とプラトー plateau プラトー（plateau） plateau（プラトー） 域の両方をカバー）。BAPNAの水溶解度上限は約10 mM。
2. 各濃度で吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） を経時測定し、生成物濃度が時間に対して直線関係を示す初期区間から初速度 initial velocity 初速度（initial velocity） initial velocity（初速度） を求める。
3. p-ニトロアニリンp-nitroaniline p-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） 濃度を時間に対してプロットし、直線部分の傾きから初速度 initial velocity初速度（initial velocity） initial velocity（初速度） v₀ を推定する。

⭐ なぜトリプシン trypsin トリプシン（trypsin） trypsin（トリプシン） は酸性・非緩衝のHClで保存する？ 中性pHではトリプシン trypsin トリプシン（trypsin） trypsin（トリプシン） は自己消化 autodigestion 自己消化（autodigestion） autodigestion（自己消化） （トリプシンtrypsin トリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン） 分子どうしが互いを切断する）を起こす。酸性で保存すると活性が抑えられ自己分解を防げる。

パラメータの推定

2つの近縁な式で解析する。

適合度は残差や誤差二乗和を中心に評価する。Lineweaver–Burkは低[S]の誤差を拡大するため、推定には直接フィットを用い、逆数プロットは補助的に扱う。

まとめ

• トリプシンtrypsin トリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン） はArg/Lysの後ろを切るセリンプロテアーゼ serine proteaseセリンプロテアーゼ（serine protease） serine protease（セリンプロテアーゼ）。ペプチド・エステル・アミド結合amide bond アミド結合（amide bond）amide bond（アミド結合） を加水分解。
• 実習では合成基質 synthetic substrate 合成基質（synthetic substrate） synthetic substrate（合成基質） BAPNAを切らせ、遊離するp-ニトロアニリン p-nitroaniline p-ニトロアニリン（p-nitroaniline） p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） の吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） 増加で速度を測る。波長と吸光係数 extinction coefficient / molar absorptivity 吸光係数（extinction coefficient / molar absorptivity） extinction coefficient / molar absorptivity（吸光係数） は測定条件に合わせる。
• 5通りの[S₀]（0.1–20×Km、Km≈2 mM）で初速度 initial velocity 初速度（initial velocity） initial velocity（初速度） を測り、Beer–Lambertで濃度換算。
• ミカエリス・メンテン直接フィット（Solver、誤差二乗和の最小化）でVmax・Kmを推定し、Lineweaver–Burkは補助的に比較する。
• トリプシンtrypsin トリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン） は自己消化 autodigestion 自己消化（autodigestion） autodigestion（自己消化） を防ぐため酸性HClで保存する。