酵素速度論：トリプシンの速度論的パラメータの決定

🧠 実習では「発色性合成基質BAPNAを切らせ、遊離するp-ニトロアニリンp-nitroanilinep-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン）の405 nm吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）の増加＝反応速度reaction rate反応速度（reaction rate）reaction rate（反応速度）」としてトリプシンtrypsinトリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン）のVmax・Kmを測る、と読む。 5通りの基質濃度substrate levels基質濃度（substrate levels）substrate levels（基質濃度）で初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）を測り、Beer–Lambert則で濃度に換算、ミカエリス・メンテン式に直接フィット（またはLineweaver–Burk）してパラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）を求める。前回の理論の実践版。

トリプシンの性質

トリプシンtrypsinトリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン）は哺乳類mammal哺乳類（mammal）mammal（哺乳類）の腸に存在するセリンプロテアーゼserine proteaseセリンプロテアーゼ（serine protease）serine protease（セリンプロテアーゼ）。生理的基質physiological substrate生理的基質（physiological substrate）physiological substrate（生理的基質）はタンパク質・ペプチドだが、アルギニンarginine (Arg)アルギニン（arginine (Arg)）arginine (Arg)（アルギニン）・リジンのカルボキシル基carboxyl groupカルボキシル基（carboxyl group）carboxyl group（カルボキシル基）が作る結合なら、ペプチド結合だけでなくエステル結合ester bondエステル結合（ester bond）ester bond（エステル結合）・アミド結合も加水分解する。この性質を酵素活性測定に利用する。

発色基質BAPNAとアミド分解活性

合成基質 BAPNA（Nα-benzoyl-DL-arginine-p-nitroanilide） を用いる。加水分解で p-ニトロアニリンp-nitroanilinep-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン） が遊離する。

flowchart TD
  A["BAPNA（無色、Argのアミド）"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='trypsin'>トリプシン</span>がアミド結合を加水分解"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='p-nitroaniline'>p-ニトロアニリン</span>遊離（黄色、405 nm）"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>増<span class='jp-term jp-term-diagram' title='acceleration'>加速度</span> ∝ <span class='jp-term jp-term-diagram' title='trypsin'>トリプシン</span>活性 = <span class='jp-term jp-term-diagram' title='initial velocity'>初速度</span> v"]

💡 吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）の増加速度acceleration加速度（acceleration）acceleration（加速度）がそのまま初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）。 p-ニトロアニリンp-nitroanilinep-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン）の遊離量＝切断されたBAPNA量なので、405 nm吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）の時間変化が反応速度reaction rate反応速度（reaction rate）reaction rate（反応速度）vに比例する。Beer–Lambert則（A = ε·c·l、l=1 cm）で吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）をp-ニトロアニリンp-nitroanilinep-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン）濃度に換算する。

実験条件と手順

1. 5通りの基質濃度substrate levels基質濃度（substrate levels）substrate levels（基質濃度）[S₀]を用意する（Km推定値≈2 mM、推奨範囲 0.1×Km < [S₀] < 20×Km、上昇域とプラトーplateauプラトー（plateau）plateau（プラトー）域の両方をカバー）。BAPNAの水溶解度上限は約10 mM。
2. 各濃度で3分間、吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）を測定。3分間は反応速度reaction rate反応速度（reaction rate）reaction rate（反応速度）≈初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）とみなす。
3. cₚₙₐ vs 時間の直線の傾きから初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度） vᵢₙᵢₜᵢₐₗ を推定。

⭐ なぜトリプシンtrypsinトリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン）は酸性・非緩衝のHClで保存する？ 中性pHではトリプシンtrypsinトリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン）は自己消化autodigestion自己消化（autodigestion）autodigestion（自己消化）（autolysis、自分自身を切る）を起こす。酸性で保存すると活性が抑えられ自己分解を防げる。

パラメータの推定

2つの近縁な式で解析する。

適合度は決定係数coefficient of determination (R²)決定係数（coefficient of determination (R²)）coefficient of determination (R²)（決定係数）R²で評価する。線形フィット（Lineweaver–Burk）と非線形non-linear非線形（non-linear）non-linear（非線形）フィット（直接M-M）を比較すると、Lineweaver–Burkは低[S]の誤差を拡大するため直接フィットの方が正確という結論conclusion結論（conclusion）conclusion（結論）になる。

まとめ

• トリプシンtrypsinトリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン）はArg/Lysの後ろを切るセリンプロテアーゼserine proteaseセリンプロテアーゼ（serine protease）serine protease（セリンプロテアーゼ）。ペプチド・エステル・アミド結合を加水分解。
• 実習では合成基質BAPNAを切らせ、遊離するp-ニトロアニリンp-nitroanilinep-ニトロアニリン（p-nitroaniline）p-nitroaniline（p-ニトロアニリン）（405 nm、ε=8270）の吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）増加で速度を測る。
• 5通りの[S₀]（0.1–20×Km、Km≈2 mM）で初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）を測り、Beer–Lambertで濃度換算。
• ミカエリス・メンテン直接フィット（Solver、SSE最小化）とLineweaver–BurkでVmax・Kmを推定。
• トリプシンtrypsinトリプシン（trypsin）trypsin（トリプシン）は自己消化autodigestion自己消化（autodigestion）autodigestion（自己消化）を防ぐため酸性HClで保存する。