Biochemistry · 2/2

平衡反応と非平衡反応；定常状態と初速度；ミカエリス・メンテン速度論；Kmとその解釈；二段階反応・二基質反応；協同性；酵素活性の単位

Equilibrium vs non-equilibrium reactions; steady state and initial rate; Michaelis–Menten kinetics; Km and its interpretation; two-step and two-substrate reactions; cooperativity; enzyme activity units — L I

応用トピック: 酵素速度論：トリプシンの速度論的パラメータの決定

🧠 酵素速度論kinetics速度論（kinetics）kinetics（速度論）は「定常状態を仮定してVmaxとKmの2数字に集約する」と読む。 平衡では正逆速度が等しくフラックスゼロ、非平衡（前方バイアスbiasバイアス（bias）bias（バイアス））ではフラックスが流れる。酵素は定常状態で働き、初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）がミカエリス・メンテン式に従う。Km・Vmax・kcat・kcat/Kmの意味を正確に掴むのが核心。

平衡と非平衡

状態	英語	特徴
平衡	equilibrium	v₁=v₋₁、ΔG=0、Q=Keq、正味フラックスなし。酵素を加えても平衡は不変
非平衡（前方バイアスbiasバイアス（bias）bias（バイアス））	non-equilibrium, forward bias	Q<Keq、ΔG<0（自発的）、正味フラックス J=v₁−v₋₁ が流れる
定常状態	steady state	各中間体[Aᵢ]が一定、各段のフラックスJᵢが等しい

💡 酵素を加えても平衡は動かない。 平衡条件では v₁ と v₋₁ が同じ倍率で上がるので平衡は不変。非平衡条件では両者が同倍率で上がる結果、正味フラックス J が増える（＝反応が速く進む）。

初速度の測定

定常状態の前方速度 v₊ だけを選んで測るには、逆反応（v₋≈0）と基質枯渇の影響を避ける。

時間窓time window時間窓（time window）time window（時間窓）Δtを短くする、酵素を少なく（[E]ₜ≪[S]）して[S]の相対変化を小さくする。
初期時間窓time window時間窓（time window）time window（時間窓）（[P]≈0）を使う → d[P]/dt = J ≈ v₊。これが「初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）」。

ミカエリス・メンテン式

E + S \underset{k_{-1}}{\overset{k_1}{\rightleftharpoons}} ES \overset{k_2}{\rightarrow} E + P

定常状態（k₁[E][S] = (k₋₁+k₂)[ES]）から、

v = \frac{V_{max}\,[S]}{K_m + [S]}, \quad V_{max}=k_2[E]_t, \quad K_m=\frac{k_{-1}+k_2}{k_1}

パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）	意味
Vmax = k₂[E]ₜ	高[S]で全酵素がES型になったときの最大速度maximum rate最大速度（maximum rate）maximum rate（最大速度）
Km = (k₋₁+k₂)/k₁	半飽和を与える[S]。Km > Kd（Kd=k₋₁/k₁）
kcat (=k₂)	触媒回転数turnover number触媒回転数（turnover number）turnover number（触媒回転数）：酵素1分子が1秒に作るP分子数

[S]の領域	挙動
[S] ≪ Km	v ≈ (Vmax/Km)[S]（[S]にほぼ比例）
[S] = Km	v = ½Vmax
[S] ≫ Km	v ≈ Vmax（[S]に依存しない、飽和）

⭐ kcat/Km は「特異性定数specificity constant特異性定数（specificity constant）specificity constant（特異性定数）」。 見かけの2次速度定数rate constant速度定数（rate constant）rate constant（速度定数）[M⁻¹s⁻¹]で、低基質濃度substrate levels基質濃度（substrate levels）substrate levels（基質濃度）での触媒効率catalytic efficiency触媒効率（catalytic efficiency）catalytic efficiency（触媒効率）を表す。極めて効率的な酵素ではk₁（拡散律速diffusion-limited拡散律速（diffusion-limited）diffusion-limited（拡散律速））に近づく。複数の基質・酵素の効率比較に最適。

Lineweaver–Burk プロット

\frac{1}{v}=\frac{K_m}{V_{max}}\cdot\frac{1}{[S]}+\frac{1}{V_{max}}

y切片=1/Vmax、x切片=−1/Km、傾き=Km/Vmax。実験データからのパラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）推定に用いる。

より現実的なモデル

二段階触媒（ES→EP→E+P）: 多くの酵素で現実的。Vmax・Kmが複数の速度定数rate constant速度定数（rate constant）rate constant（速度定数）の関数になるが、式の形はM-Mのまま。
二基質反応two-substrate二基質反応（two-substrate）two-substrate（二基質反応）:

機構	英語	特徴・例
順序無作為・三元複合体	random sequential (三者複合体ternary complex三者複合体（ternary complex）ternary complex（三者複合体）)	両基質が結合してから反応。例：GAPDH, PGK, PEPCK
ピンポン	ping-pong	第1基質が反応し酵素が修飾型(E*)に→第2基質。例：トランスアミナーゼtransaminasesトランスアミナーゼ（transaminases）transaminases（トランスアミナーゼ）

協同性

オリゴマー酵素で協同的に基質が結合すると、v–[S]曲線がS字になる（Hill式 v=Vmax[S]ⁿ/([S]ⁿ+Kⁿ)）。例：四量体tetramer四量体（tetramer）tetramer（四量体）のホスホフルクトキナーゼphosphofructokinase (PFK)ホスホフルクトキナーゼ（phosphofructokinase (PFK)）phosphofructokinase (PFK)（ホスホフルクトキナーゼ）。実際の協同性Cooperativity, Hill協同性（Cooperativity, Hill）Cooperativity, Hill（協同性）はもっと緩やか（Hbの酸素結合と同様）。

酵素活性の単位

単位	定義
酵素活性 E.A.	飽和[S]での反応速度reaction rate反応速度（reaction rate）reaction rate（反応速度）＝Vmax（=d[P]/dt）
触媒回転数turnover number触媒回転数（turnover number）turnover number（触媒回転数） kcat	Vmax/(n[E]ₜ)。酵素1分子あたりのP産生速度[s⁻¹]
実用単位 U	1 µmol/min（=飽和速度Vmax飽和速度（Vmax）Vmax（飽和速度）×試料体積）
katal	1 mol/s（SI）
比活性specific activity比活性（specific activity）specific activity（比活性） S.A.	E.A./タンパク質量[U/mg]。精製purification精製（purification）purification（精製）度の指標

⭐ 血漿酵素は「機能性」か「非機能性non-functional非機能性（non-functional）non-functional（非機能性）」かで意味が違う。 機能性血漿酵素functional plasma enzyme機能性血漿酵素（functional plasma enzyme）functional plasma enzyme（機能性血漿酵素）（プロトロンビンprothrombinプロトロンビン（prothrombin）prothrombin（プロトロンビン）、LPLなど）は肝で分泌され血中で働く → 肝不全で低下。非機能性血漿酵素non-functional plasma enzyme非機能性血漿酵素（non-functional plasma enzyme）non-functional plasma enzyme（非機能性血漿酵素）は細胞内酵素で、組織壊死tissue necrosis組織壊死（tissue necrosis）tissue necrosis（組織壊死）で漏出して上昇する（診断に利用）。多くはkcatではなく酵素量[E]ₜの変化を反映する。

まとめ

平衡では正味フラックスなし、非平衡（前方バイアスbiasバイアス（bias）bias（バイアス））でフラックスが流れる。酵素は定常状態で働く。
初速度initial velocity初速度（initial velocity）initial velocity（初速度）（[P]≈0）で測る。M-M：Vmax=k₂[E]ₜ、Km=(k₋₁+k₂)/k₁>Kd、[S]=Kmでv=½Vmax。
kcat/Kmは特異性定数specificity constant特異性定数（specificity constant）specificity constant（特異性定数）（触媒効率catalytic efficiency触媒効率（catalytic efficiency）catalytic efficiency（触媒効率））、拡散律速diffusion-limited拡散律速（diffusion-limited）diffusion-limited（拡散律速）で最大。
二基質反応two-substrate二基質反応（two-substrate）two-substrate（二基質反応）は順序無作為（三元複合体）とピンポン。協同性Cooperativity, Hill協同性（Cooperativity, Hill）Cooperativity, Hill（協同性）はS字。
活性の単位：E.A./kcat/U/katal/比活性specific activity比活性（specific activity）specific activity（比活性）。血漿酵素は機能性（肝分泌）と非機能性non-functional非機能性（non-functional）non-functional（非機能性）（組織漏出）で意味が異なる。