Biophysics · 08.06

吸収スペクトルの測定

Measurement of the absorption spectrum

🧠 吸収スペクトルabsorption spectrum吸収スペクトル（absorption spectrum）absorption spectrum（吸収スペクトル）は、波長を選んだ光についてブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）の入射強度 $I_0$ と試料透過後の強度 $I$ を比較し、吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）を波長ごとに並べて得る。装置の各部が「波長選択・基準補正・光検出」のどこを担うかを追うと測定誤差measurement error測定誤差（measurement error）measurement error（測定誤差）を理解できる。

分光光度計の構成

分光光度計spectrophotometer分光光度計（spectrophotometer）spectrophotometer（分光光度計）は、光源、波長選択部、試料セル、検出器、信号処理部から構成される。紫外域と可視域visible range可視域（visible range）visible range（可視域）では必要な光源やセル材質が異なり、石英セルは紫外光を透過するが通常のガラスやプラスチックplasticプラスチック（plastic）plastic（プラスチック）は吸収することがある。

flowchart TD
  A["光源：測定範囲を含む連続光"] --> B["モノクロメーター：狭い波長帯を選択"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='blank'>ブランク</span>を測定して I₀(λ) を取得"]
  C --> D["試料セルを透過した I(λ) を検出"]
  D --> E["A(λ)=-log₁₀[I(λ)/I₀(λ)]"]
  E --> F["波長を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='scanning'>走査</span>して<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorption spectrum'>吸収スペクトル</span>を作成"]

ブランク測定の役割

ブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）は溶媒、セル、試薬による吸収と光学系の波長依存性を $I_0(\lambda)$ へ含め、目的成分以外の寄与を差し引く基準である。試料とブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）ではセルの向き、液量、光路長optical path length光路長（optical path length）optical path length（光路長）、表面の汚れをそろえる。

吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）への変換はLambert–Beerの法則に従う。

A(\lambda)=-\log_{10}\!\left[\frac{I(\lambda)}{I_0(\lambda)}\right]

単一ビーム装置はブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）と試料を順番に測るため、その間の光源変動が誤差になる。二光束式double-beam system二光束式（double-beam system）double-beam system（二光束式）は試料側と参照側を同時または交互alternating交互（alternating）alternating（交互）に測り、時間的ドリフトを補正しやすい。

波長分解能と測定誤差

要因	スペクトルへの影響
スリット幅slit widthスリット幅（slit width）slit width（スリット幅）・帯域幅	広すぎると近接ピークが平均化される
迷光stray light迷光（stray light）stray light（迷光）	高吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）域で $I$ を過大評価し、吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）を低く見積もる
濁り・気泡air bubble気泡（air bubble）air bubble（気泡）	散乱によりベースラインが上昇する
セルの汚れ・指紋fingerprints指紋（fingerprints）fingerprints（指紋）	波長依存しない見かけの減弱を加える
検出器の飽和・雑音	低透過率transmittance透過率（transmittance）transmittance（透過率）域や弱信号域で精度を落とす

濁った試料では、比濁法turbidimetry比濁法（turbidimetry）turbidimetry（比濁法）・散乱比濁法nephelometry散乱比濁法（nephelometry）nephelometry（散乱比濁法）で扱う散乱が透過光を減らす。測定した変化が吸収ピークか散乱背景かは、スペクトル形状とブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）から判断する。

スペクトルから濃度・状態を求める

吸収スペクトルabsorption spectrum吸収スペクトル（absorption spectrum）absorption spectrum（吸収スペクトル）の性質に基づき、目的成分の $\lambda_{\max}$ や成分間の吸収差が大きい波長を選ぶ。既知濃度系列から検量線calibration curve検量線（calibration curve）calibration curve（検量線）を作り、直線範囲の未知試料へ適用する。複数成分が重なる場合は複数波長の連立式やスペクトルフィッティングFittingフィッティング（Fitting）Fitting（フィッティング）を使う。

パルスオキシメトリpulse oximetryパルスオキシメトリ（pulse oximetry）pulse oximetry（パルスオキシメトリ）は酸素化・脱酸素化ヘモグロビンdeoxyhemoglobin脱酸素化ヘモグロビン（deoxyhemoglobin）deoxyhemoglobin（脱酸素化ヘモグロビン）の吸収差を複数波長で読み分ける例であり、濃度だけでなく化学状態の違いを利用している。

まとめ

分光光度計spectrophotometer分光光度計（spectrophotometer）spectrophotometer（分光光度計）は光源、波長選択部、試料・ブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）、検出器から構成される。
ブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）は溶媒・セル・装置の寄与を $I_0(\lambda)$ として補正する。
波長走査scanning走査（scanning）scanning（走査）した吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度） $A(\lambda)$ が吸収スペクトルabsorption spectrum吸収スペクトル（absorption spectrum）absorption spectrum（吸収スペクトル）になる。
帯域幅、迷光stray light迷光（stray light）stray light（迷光）、散乱、セル汚れ、検出器範囲を管理して初めて定量できる。