Biophysics · 10.11

蛍光分光光度計

The fluorescence spectrometer

🧠 蛍光分光光度計fluorescence spectrometer蛍光分光光度計（fluorescence spectrometer）fluorescence spectrometer（蛍光分光光度計）は、励起波長と発光波長を別々に選び、強い励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）から弱い蛍光を空間・波長の両方で分離して測る装置である。

光学系の測定経路

flowchart TD
  A["光源"] --> B["励起モノクロメーター<br>入射波長を選択"]
  B --> C["試料<br>蛍光を発生"]
  C --> D["入射軸に対し90°方向で集光"]
  D --> E["発光モノクロメーター<br>検出波長を選択"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='photomultiplier'>光電子増倍管</span>などの検出器"]
  F --> G["波長ごとの強度を記録"]

二つの分光器spectrometer分光器（spectrometer）spectrometer（分光器）を独立に走査scanning走査（scanning）scanning（走査）することで、励起スペクトルexcitation spectrum励起スペクトル（excitation spectrum）excitation spectrum（励起スペクトル）と発光スペクトルemission spectrum発光スペクトル（emission spectrum）emission spectrum（発光スペクトル）を取得できる。

90度配置の意味

透過した励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）は入射方向へ進むため、検出器を通常90°に置くと直接光direct light直接光（direct light）direct light（直接光）を避けられる。ただしレイリー散乱、ラマン散乱Raman scatteringラマン散乱（Raman scattering）Raman scattering（ラマン散乱）、迷光stray light迷光（stray light）stray light（迷光）は残るため、波長選択とブランクblankブランク（blank）blank（ブランク）測定が必要である。

定量を乱す要因

低濃度では蛍光強度が濃度にほぼ比例するが、高吸光度absorbance吸光度（absorbance）absorbance（吸光度）では励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）が試料手前で吸収される内フィルターbarrierフィルター（barrier）barrier（フィルター）効果や自己吸収が生じる。観測値には量子収率だけでなく、光源強度と検出器の波長感度も含まれる。

まとめ

励起側と発光側の波長選択器を独立に備える。
90°検出は透過励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）を減らし、蛍光の信号対背景比を高める。
定量では迷光stray light迷光（stray light）stray light（迷光）、内フィルターbarrierフィルター（barrier）barrier（フィルター）効果、装置の波長応答を管理する。