蛍光顕微鏡

🧠 蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）は、特定分子だけに蛍光標識fluorescent label蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識）を結合し、励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）と発光を波長で分けることで、明るい背景中の形ではなく分子局在を可視化する。

落射蛍光の光路

flowchart TD
  A["光源"] --> B["励起<span class='jp-term jp-term-diagram' title='barrier'>フィルター</span>"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='dichroic mirror'>ダイクロイックミラー</span>で反射"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='objective lens'>対物レンズ</span>から試料を励起"]
  D --> E["長波長の蛍光を同じ対物で回収"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='dichroic mirror'>ダイクロイックミラー</span>を透過"]
  F --> G["発光<span class='jp-term jp-term-diagram' title='barrier'>フィルター</span>"]
  G --> H["眼・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='camera'>カメラ</span>で像を形成"]

ダイクロイックミラーdichroic mirrorダイクロイックミラー（dichroic mirror）dichroic mirror（ダイクロイックミラー）は短波長の励起光excitation light励起光（excitation light）excitation light（励起光）を反射し、長波長側の蛍光を透過させる。

コントラストの由来

標識分子marker molecule標識分子（marker molecule）marker molecule（標識分子）が存在する場所だけが発光するため、形態染色とは異なる分子特異性を得られる。複数の蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）では、励起・発光帯域の重なりと漏れ込みを考慮する。色素間の近接を測る場合はFRETを利用できる。

画質を制限する現象

焦点外蛍光は像をぼかし、強い照明は光退色photobleaching光退色（photobleaching）photobleaching（光退色）と光毒性phototoxicity光毒性（phototoxicity）phototoxicity（光毒性）を生む。退色blanching退色（blanching）blanching（退色）を単なる欠点で終わらせず分子移動の測定へ使う方法がFRAPである。

⚠️ 明るさの差は分子量の差だけでなく、照明むら、焦点、量子収率、退色blanching退色（blanching）blanching（退色）にも左右される。

まとめ

• 励起フィルターbarrierフィルター（barrier）barrier（フィルター）、ダイクロイックミラーdichroic mirrorダイクロイックミラー（dichroic mirror）dichroic mirror（ダイクロイックミラー）、発光フィルターbarrierフィルター（barrier）barrier（フィルター）が光を分離する。
• 蛍光標識fluorescent label蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識）により特定分子の局在を高コントラストcontrastコントラスト（contrast）contrast（コントラスト）で示せる。
• 定量画像では焦点外光、漏れ込み、退色blanching退色（blanching）blanching（退色）、光毒性phototoxicity光毒性（phototoxicity）phototoxicity（光毒性）を管理する。