Molecular Cell Biology · 80

in vitro転写・翻訳

In vitro transcription and translation

🧠 この実験は「生きた細胞を使わずにタンパク質を作る」という無細胞タンパク質合成cell-free protein synthesis無細胞タンパク質合成（cell-free protein synthesis）cell-free protein synthesis（無細胞タンパク質合成）の実演であり、真核生物の通常のmRNA成熟過程（キャップ形成cappingキャップ形成（capping）capping（キャップ形成）・スプライシング・ポリアデニル化polyadenylationポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化））を、それぞれ人工的な代替物で置き換えるという発想で成り立つ。キャップの代わりにGAAトリプレット+タバコtobaccoタバコ（tobacco）tobacco（タバコ）モザイクウイルスエンハンサーenhancerエンハンサー（enhancer）enhancer（エンハンサー）配列、ポリA鎖の代わりに長い3’非翻訳領域、スプライシングの代わりにあらかじめイントロンを除いたcDNAを使う——生細胞が担っていた「品質保証quality assurance (QA)品質保証（quality assurance (QA)）quality assurance (QA)（品質保証）」の役割を、化学的に安定な代替配列に肩代わりさせることで、試験管の中だけで転写と翻訳を完結させる。

転写

真核生物におけるmRNA成熟には、キャップ形成cappingキャップ形成（capping）capping（キャップ形成）、スプライシング、ポリアデニル化polyadenylationポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化）が含まれる（16-processing-of-the-eukaryotic-mrna参照）。しかしin vitro転写アッセイにはRNAプロセシング因子が存在しない。したがって、これら3つの過程はそれぞれ人工的な代替物で置き換えられる：

キャップなし： メチルグアノシンキャップmethylguanosine capメチルグアノシンキャップ（methylguanosine cap）methylguanosine cap（メチルグアノシンキャップ）は、mRNA中でGAAトリプレットとそれに続くタバコtobaccoタバコ（tobacco）tobacco（タバコ）モザイクウイルスエンハンサーenhancerエンハンサー（enhancer）enhancer（エンハンサー）（オメガ）配列に置き換えられうる
ポリA鎖なし： 終止コドンstop codon終止コドン（stop codon）stop codon（終止コドン）の下流に位置する長い3’非翻訳領域が、mRNAの安定性を大幅に改善しうる
スプライシングなし： 目的遺伝子のcDNA（コピーDNA）がベクターにクローニングcloningクローニング（cloning）cloning（クローニング）される

翻訳

無細胞タンパク質合成cell-free protein synthesis無細胞タンパク質合成（cell-free protein synthesis）cell-free protein synthesis（無細胞タンパク質合成）：

生きた細胞を用いずに試験管内でタンパク質を合成する
翻訳に必要な要素：リボソーム、mRNA、アミノアシルtRNAaminoacyl-tRNAアミノアシルtRNA（aminoacyl-tRNA）aminoacyl-tRNA（アミノアシルtRNA）、アミノ酸

→ GFP＝ 緑色蛍光タンパク質（実験室でマーカーとして用いられる）。

翻訳反応

コムギ胚芽抽出液wheat germ extractコムギ胚芽抽出液（wheat germ extract）wheat germ extract（コムギ胚芽抽出液）はリボソーム、RNA類、翻訳因子、アミノアシルtRNA合成酵素aminoacyl-tRNA synthetaseアミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase）aminoacyl-tRNA synthetase（アミノアシルtRNA合成酵素）、エネルギー源を含む。

基質： アミノ酸基質
翻訳の鋳型： mRNA（in vitroで合成されたもの）
二層epiblast/hypoblast二層（epiblast/hypoblast）epiblast/hypoblast（二層）構造： 1本の試験管には全ての成分を含め、もう1本の試験管にはRNAポリメラーゼを含めない（mRNAが合成されない対照）

flowchart TD
  A["cDNA（イントロンなし）をベクターへ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='cloning'>クローニング</span>"] --> B["in vitro転写：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='bacteriophage'>バクテリオファージ</span>RNAポリメラーゼ"]
  B --> C["GAAトリプレット+<span class='jp-term jp-term-diagram' title='enhancer'>エンハンサー</span>配列（キャップの代替）+長い3'UTR（ポリAの代替）を持つmRNA"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='wheat germ extract'>コムギ胚芽抽出液</span>（リボソーム・tRNA・翻訳因子・アミノ酸）との<span class='jp-term jp-term-diagram' title='epiblast/hypoblast'>二層</span>構成"]
  D --> E["インキュベートによる翻訳"]
  E --> F["GFPの産生→誘導光発光による検出"]

まとめ

in vitro転写では、真核生物の通常のmRNA成熟過程（キャップ形成cappingキャップ形成（capping）capping（キャップ形成）、スプライシング、ポリアデニル化polyadenylationポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化））がRNAプロセシング因子の非存在下で行われるため、GAAトリプレット+タバコtobaccoタバコ（tobacco）tobacco（タバコ）モザイクウイルスエンハンサーenhancerエンハンサー（enhancer）enhancer（エンハンサー）配列（キャップの代替）、長い3’UTR（ポリAの代替）、あらかじめイントロンを除いたcDNA（スプライシングの代替）といった人工的な代替物が用いられる。
in vitro翻訳（無細胞タンパク質合成cell-free protein synthesis無細胞タンパク質合成（cell-free protein synthesis）cell-free protein synthesis（無細胞タンパク質合成））はコムギ胚芽抽出液wheat germ extractコムギ胚芽抽出液（wheat germ extract）wheat germ extract（コムギ胚芽抽出液）（リボソーム、tRNA、翻訳因子、アミノ酸、エネルギー源を含む）とin vitro合成されたmRNAを用いて、生きた細胞なしにGFPなどの目的タンパク質を試験管内で産生する。