Molecular Cell Biology · 79

組換えDNAの解析と作製

Analysis and generation of a recombinant DNA

🧠 組換えDNA作製は「ベクター準備→インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）準備→ライゲーションligationライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション）→形質転換→クローン選択clonal selection theoryクローン選択（clonal selection theory）clonal selection theory（クローン選択）」という5段階の直線的な組み立てラインであり、各段階には「うまくいかなかった場合にどう見分けるか」という検証機構が埋め込まれている。制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）とリガーゼligaseリガーゼ（ligase）ligase（リガーゼ）が「同じ切り口」を作ってパズルのピースのように継ぎ合わせ、CaCl2と熱ショックが細菌の膜に一時的な孔を開けてDNAを招き入れ、そして青白選択（負の選択negative selection負の選択（negative selection）negative selection（負の選択））は「インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）が入ればlacZが壊れて白、入らなければlacZが機能して青」という巧妙な仕掛けでコロニーレベルでの成功を可視化する——正の選択positive selection正の選択（positive selection）positive selection（正の選択）（ccdBのような致死遺伝子破壊）と負の選択negative selection負の選択（negative selection）negative selection（負の選択）（青白判定）は、同じ「インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）挿入の成否を色/生死という目に見える形に変換する」という原理の2つの実装である。

分子クローニング

組換えDNA＝ インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）DNA＋ベクターDNA→別の細胞にそのタンパク質を産生させる。

適切なベクターを見つける
インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）を準備する→GFP（緑色蛍光タンパク質）をコードする
ライゲーションligationライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション）： 制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）を用いてそれらの末端を適合させる
形質転換： 組換えDNAを細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）に入れる
コロニースクリーニングcolony screeningコロニースクリーニング（colony screening）colony screening（コロニースクリーニング）

ベクター

今日用いられるベクターの大部分は、プラスミド（天然に存在する細菌の染色体外・自己複製・環状二本鎖DNAcircular double-stranded DNA環状二本鎖DNA（circular double-stranded DNA）circular double-stranded DNA（環状二本鎖DNA）分子）の改変版である。利用可能なベクターは通常組換えタンパク質産生（ベクターの発現）→GFPの産生に用いられる。発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）は、対応する真核生物由来natural/biological sources生物由来（natural/biological sources）natural/biological sources（生物由来）の発現系においてタンパク質コード領域インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）の転写を駆動するのに不可欠な調節要素を持つものが実装される。

発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）の性質：

複製起点ori複製起点（ori）ori（複製起点）： 宿主細胞内でのベクターの複製を保証する
プロモーター配列promoter sequenceプロモーター配列（promoter sequence）promoter sequence（プロモーター配列）（SP6）： RNAポリメラーゼを含む前開始複合体initiation complex開始複合体（initiation complex）initiation complex（開始複合体）の組み立て部位→オペレーターoperatorオペレーター（operator）operator（オペレーター）領域
マルチクローニングサイトmultiple cloning site (MCS)マルチクローニングサイト（multiple cloning site (MCS)）multiple cloning site (MCS)（マルチクローニングサイト）：プラスミドを開くのを助ける制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）認識配列を含む
選択マーカー（amp^R）： 細菌に抗生物質antibiotics抗生物質（antibiotics）antibiotics（抗生物質）耐性を持たせる選択マーカー遺伝子。アンピシリン（βラクタム系抗生物質antibiotics抗生物質（antibiotics）antibiotics（抗生物質）→翻訳機構を破壊する）

インサート

ベクターに挿入される目的の配列（インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）、遺伝子）は目的タンパク質＝GFPをコードする。インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）は通常cDNA（コピーDNA）/gDNA（ゲノムDNA）からPCRを用いて増幅される。プライマーは配列内に制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）認識部位＋開始/終止コドンstop codon終止コドン（stop codon）stop codon（終止コドン）を持つよう設計される。ベクターと同じ制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）を用いて切断される。

→ プライマー：目的遺伝子を増幅する。

制限酵素消化とライゲーション

制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）は短い、4〜8ヌクレオチド長の回文配列palindromic sequence回文配列（palindromic sequence）palindromic sequence（回文配列）を認識し、両鎖を切断する結果、遊離の3’ OHと5’ OH基が形成される。

リガーゼligaseリガーゼ（ligase）ligase（リガーゼ）は、あるDNA末端の3’-ヒドロキシル基hydroxyl groupヒドロキシル基（hydroxyl group）hydroxyl group（ヒドロキシル基）ともう一方の5’-リン酸基phosphate groupリン酸基（phosphate group）phosphate group（リン酸基）の間にホスホジエステル結合phosphodiester bondホスホジエステル結合（phosphodiester bond）phosphodiester bond（ホスホジエステル結合）を形成することにより、DNA断片の末端をつなぎ合わせる（この反応にはATPを要する）。

flowchart TD
  A["ベクター準備：制限消化・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='dephosphorylation'>脱リン酸化</span>"] --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligation'>ライゲーション</span>：T4 DNA<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligase'>リガーゼ</span>"]
  B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='insert'>インサート</span>準備：制限消化・PCR増幅"] --> C
  C --> D["組換えDNA（pEU-E01-GFP）"]
  D --> E["形質転換：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competent (cell, as in transformation)'>コンピテント</span>細胞への導入"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='colony screening'>コロニースクリーニング</span>：青白選択・制限消化・コロニーPCR・シーケンシング"]

形質転換

形質転換とは、組換えDNAベクターがコンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）に取り込まれることである。

水平（側方）遺伝子伝達： 細胞に取り込まれたプラスミドが細菌のゲノムDNAへ組み込まれること。

コンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細胞： 化学的コンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細胞＋エレクトロコンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細胞がDNAを取り込む。

人工的コンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細胞は、環境からDNAを取り込むために化学物質chemical substance化学物質（chemical substance）chemical substance（化学物質）で処理された細胞である。その機序は、DNAが細胞の外膜に開く微小な孔を通って細菌へ入るというものである。

細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）をCaCl2で処理することで、DNAと脂質二重層lipid bilayer脂質二重層（lipid bilayer）lipid bilayer（脂質二重層）の間の反発力が排除される→組換えDNAが細胞膜に近づく。細胞は熱ショック中に加熱される→細胞膜の透過性亢進と脂質膜内の孔形成→細胞がプラスミドを取り込めるようになる。次に、細胞は氷上に置くことで急速に冷却され、細菌膜が再生できるようにする。

クローンの選択

→ ベクター構築物を確認する必要がある——インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）が正しい方向に挿入されていない場合や、ベクターが自身だけで閉環する場合（＝空ベクター）があるためである。

コロニーPCR： 細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）を溶解し、そのDNA含量の一部をインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）特異的またはベクター特異的プライマーで増幅する。増幅されたDNA断片はアガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）により可視化される。

正の選択positive selection正の選択（positive selection）positive selection（正の選択）： 正の選択positive selection正の選択（positive selection）positive selection（正の選択）ベクターは、その産物が細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）にとって致死的である遺伝子（ccdBなど、DNAジャイレースDNA gyraseDNAジャイレース（DNA gyrase）DNA gyrase（DNAジャイレース）の強力な阻害因子）を含む。インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）の挿入が成功すると、この毒性遺伝子の読み枠reading frame読み枠（reading frame）reading frame（読み枠）が破壊され、組換えクローンが生存可能viable生存可能（viable）viable（生存可能）になる。

負の選択negative selection負の選択（negative selection）negative selection（負の選択）：

β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）（lacオペロン）コード遺伝子の一部を欠く遺伝子改変大腸菌株がここで用いられる。β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）の欠損サブユニットはクローニングベクターcloning vectorクローニングベクター（cloning vector）cloning vector（クローニングベクター）を用いて発現される
β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）活性は空ベクターを含む細胞にのみ存在する。この活性は人工ラクトース類似体であるX-galを用いて追跡でき、これは酵素的加水分解を受けると青色の産物を生じる。インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）を含むコロニーは寒天プレート上で無色に見える

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='lacZ+MCS+AmpR'>プラスミドベクター</span>+外来DNA"] --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligation'>ライゲーション</span>"]
  B --> C{"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='insert'>インサート</span>はlacZ内に挿入されたか？"}
  C -->|"挿入あり：lacZが破壊される"| D["形質転換→X-Gal+IPTG培地で培養"]
  C -->|"挿入なし：lacZが機能する"| D
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='insert'>インサート</span>あり：β-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='galactosidase'>ガラクトシダーゼ</span>非切断→白色コロニー"]
  D --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='insert'>インサート</span>なし（空ベクター）：X-Gal切断→青色コロニー"]

⭐ 正の選択positive selection正の選択（positive selection）positive selection（正の選択）（ccdBのような致死遺伝子の破壊）と負の選択negative selection負の選択（negative selection）negative selection（負の選択）（青白判定）は、いずれも「インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）挿入の成否」を目に見える形（生死、色）に変換するという同じ原理の異なる実装である。正の選択positive selection正の選択（positive selection）positive selection（正の選択）は「インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）がなければ死ぬ」という強制、負の選択negative selection負の選択（negative selection）negative selection（負の選択）は「インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）がなければ青くなる」という識別であり、前者はより厳格な選抜、後者はより穏やかな識別として使い分けられる。

まとめ

組換えDNA作製はベクター（複製起点ori複製起点（ori）ori（複製起点）・プロモーター・MCS・選択マーカーを持つ）とインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）（PCR増幅された目的遺伝子）を同じ制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）で切断しリガーゼligaseリガーゼ（ligase）ligase（リガーゼ）で連結することにより行われる。
形質転換はCaCl2処理と熱ショックによりコンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）の膜に一時的な孔を作り、組換えDNAを細胞内へ取り込ませることで達成される。
クローンの選択にはコロニーPCR、正の選択positive selection正の選択（positive selection）positive selection（正の選択）（ccdBなど致死遺伝子の破壊による生存選抜）、負の選択negative selection負の選択（negative selection）negative selection（負の選択）（lacZを利用した青白選択、X-Galによる呈色判定）が用いられ、いずれもインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）挿入の成否を目に見える形（生死・色）に変換する。