Molecular Cell Biology · 17

PCRおよびリアルタイムPCRの機能と応用

Function and application of PCR and real-time PCR

応用トピック: 法医DNA鑑定腫瘍の分子病理

🧠 PCR（ポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、polymerase chain reaction）は「変性→アニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）→伸長」という3段階の温度サイクルを指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）に繰り返すだけの単純な原理でありながら、DNAを2ⁿ倍（40サイクルなら2⁴⁰倍）に増幅する。旧来のPCRが増幅産物を「反応が終わった後」に電気泳動で見るのに対し、リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）は蛍光シグナルを「反応の最中」に追跡する——この「後で見る」から「今見る」への転換が、定性的検出から定量的解析への飛躍を可能にした。

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）とは

PCRは分子生物学で用いられる技術で、DNAの1コピーまたは少数コピーのセグメントを数桁にわたり増幅し、特定のDNA配列の数千〜数百万コピーを生成する。これにより電気泳動（可視化用）または即座のリアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）によって特定の遺伝子を検出できるようになる。

大部分のPCR法は熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）に依存する——反応混合物reaction mixture反応混合物（reaction mixture）reaction mixture（反応混合物）を反復的な加熱・冷却サイクルに曝すことで、異なる温度依存性biological temperature dependence温度依存性（biological temperature dependence）biological temperature dependence（温度依存性）反応を可能にする。

標的領域に相補的な配列を含むプライマーとDNAポリメラーゼ（この方法の名前の由来）が選択性と反復増幅を可能にする。PCRが進行するにつれ、生成されたDNA自体が複製の鋳型として使われ、連鎖反応が始動し、元のDNA鋳型が指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）に増幅される。つまり各サイクルで、存在する全てのDNA分子が半保存的複製semiconservative replication半保存的複製（semiconservative replication）semiconservative replication（半保存的複製）（05-principles-of-the-semiconservative-dna-replication-replication-fork-leading-and参照）を行う。

ほぼ全てのPCRは熱安定性DNAポリメラーゼ——Taqポリメラーゼ（好熱性thermophilic好熱性（thermophilic）thermophilic（好熱性）細菌から最初に単離された酵素）を用いる。このDNAポリメラーゼは一本鎖DNAsingle-stranded DNA一本鎖DNA（single-stranded DNA）single-stranded DNA（一本鎖DNA）を鋳型とし、プライマーによりDNA合成を開始させ、遊離ヌクレオチドから新しいDNA鎖を酵素的に組み立てる。

前述の通り、DNAポリメラーゼは新規鎖の合成を開始できない（既存鎖の伸長のみ継続可能）ため、複製したい鋳型を指し示すためにプライマー分子を用いる。PCRで用いられるプライマーは人工の一本鎖DNAsingle-stranded DNA一本鎖DNA（single-stranded DNA）single-stranded DNA（一本鎖DNA）である（自然界のような通常の二本鎖RNAではない）。プライマーはゲノム中の相補領域に結合する——これによりどの領域を増幅したいかを選択する。

PCR手順（熱サイクル）

PCRの熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）は3つの段階に分けられる：

flowchart TD
  A["1. 変性（denaturation、94〜96℃、約45秒）"] --> B["水素結合が切断→鋳型となる<span class='jp-term jp-term-diagram' title='single-stranded DNA'>一本鎖DNA</span>"]
  B --> C["2. <span class='jp-term jp-term-diagram' title='annealing'>アニーリング</span>（annealing、約68℃、30〜60秒）"]
  C --> D["フォワード・リバース2種のプライマーが各ssDNA鋳型の3'端に結合"]
  D --> E["3. 伸長（elongation、約72℃、Taqポリメラーゼの至適温度）"]
  E --> F["DNAポリメラーゼが5'→3'方向へ遊離ヌクレオチドを付加し新鎖合成"]
  F --> A

1. 変性（95℃）

二本鎖DNAが95℃（45秒）で熱変性する——相補塩基間の水素結合が切断され、DNAの一本鎖鋳型が得られる。

2. アニーリング（55℃前後）

反応温度が50〜72℃（30〜60秒）まで下げられ、プライマーが各ssDNA鋳型へアニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）できるようになる。2種のプライマー（それぞれ標的反応混合物reaction mixture反応混合物（reaction mixture）reaction mixture（反応混合物）を含む2つのssDNA相補鎖に対応、フォワード＋リバース）が必要である。プライマーは各鎖の3′端に結合する短い一本鎖配列で、増幅されるべき領域の境界を示す（DNAポリメラーゼの開始点）。プライマーの鎖へのハイブリダイゼーションhybridizationハイブリダイゼーション（hybridization）hybridization（ハイブリダイゼーション）を可能にする——塩基間の安定なH結合を達成する——ために十分低い温度であることが重要である。

3. 伸長（72℃）

プライマーの伸長は72℃で起こる（熱安定性Taqポリメラーゼの至適温度に対応）。DNAポリメラーゼによるDNA増幅：反応混合物reaction mixture反応混合物（reaction mixture）reaction mixture（反応混合物）中の遊離ヌクレオチドを（5′→3′方向に）付加することで、DNA鋳型鎖に相補的な新しいDNA鎖を合成する。増幅産物の量はプライマー・ヌクレオチド・DNAポリメラーゼの寿命によって決まる。

各サイクル後、DNA配列は倍加する。コピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）の計算式は2ⁿ（nはサイクル数）。通常この熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）は約40回（40サイクル）繰り返されるため、2⁴⁰個のコピーが得られる。

⭐ PCR第2サイクル（およびそれ以降）でDNA合成が行われる際、元の鋳型鎖上のプライマー位置で止まらない。 元の長い鋳型鎖の数は直線的に増加する（各サイクルで2本の新しい元の長鎖が生じる）が、新規合成鎖の数は指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）に増加する。

反応混合物

成分	内容
DNA鋳型	1〜100 ng、調査/増幅対象のDNA
プライマー（×2）	増幅されるセグメントを決定する
dNTP（デオキシリボヌクレオシドnucleosideヌクレオシド（nucleoside）nucleoside（ヌクレオシド）三リン酸）	新鎖の構成要素（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）
DNAポリメラーゼ	新しいDNA鎖を合成（熱安定性——変性しない）
緩衝液	DNA依存性DNAポリメラーゼに最適な環境を提供（最後に添加）

応用

遺伝子変異/多型の調査→候補遺伝子candidate gene候補遺伝子（candidate gene）candidate gene（候補遺伝子）（リスク因子）の同定、遺伝性疾患の診断（単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）または複合疾患complex disease複合疾患（complex disease）complex disease（複合疾患））
「外来」ゲノムの同定：細菌・ウイルス→感染症の診断
犯罪学：親子鑑定paternity test親子鑑定（paternity test）paternity test（親子鑑定）、遺伝子指紋fingerprints指紋（fingerprints）fingerprints（指紋）（犯人の同定）
遺伝子調節の調査→遺伝子発現解析、（m）RNAの定量的決定
遺伝子の機能/調節の解析、組換えタンパク質の産生→医薬品（発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）・レポーターベクター、19-generation-and-application-of-recombinant-dna-reporter-and-expression-vectors参照）

ゲル電気泳動

電気泳動は荷電charged荷電（charged）charged（荷電）高分子（RNA、DNA、タンパク質、炭水化物）をその物理的性質physical nature物理的性質（physical nature）physical nature（物理的性質）に応じて分離する技術である。分離は溶液中の荷電charged荷電（charged）charged（荷電）成分が電場electric field電場（electric field）electric field（電場）の作用下で異なる速度で移動するという事実に基づく。サイズによる分離：

小さな分子→抵抗が小さい→移動度mobility移動度（mobility）mobility（移動度）が大きい→移動距離が長い（速い）
大きな分子→抵抗が大きい→移動度mobility移動度（mobility）mobility（移動度）が小さい→移動距離が短い（遅い）

→ ゲルの孔径pore size孔径（pore size）pore size（孔径）が分子の移動速度を決定する。

インターカレーター色素intercalator dyeインターカレーター色素（intercalator dye）intercalator dye（インターカレーター色素）はUV光を用いて蛍光を発生させ、ゲル内のDNAを可視化できるようにする。DNAは（リン酸基phosphate groupリン酸基（phosphate group）phosphate group（リン酸基）のため）負電荷を帯びており、正極へ移動する。

リアルタイムPCR

従来型conventional従来型（conventional）conventional（従来型）PCRでは、増幅されたDNA産物（アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）、amplicon）はエンドポイント解析で検出される
対照的に、リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）では増幅産物の蓄積が反応進行と同時に測定される——リアルタイムで、つまりPCR中に結果が得られる（後ではなく）

PCR産物のリアルタイム検出は、各反応に含まれる蛍光レポーター分子によって可能となり、産物DNA量の増加とともに蛍光が増加する。蛍光検出fluorescence detection蛍光検出（fluorescence detection）fluorescence detection（蛍光検出）モジュールを備えた特殊なサーマルサイクラーが、増幅が進行する際の蛍光シグナルをモニタリングする。測定された蛍光は増幅されたDNA産物（アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン））の総量に比例し、経時的serial経時的（serial）serial（経時的）な蛍光変化から各サイクルで産生されたアンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）量が算出される。

リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）により鋳型DNAを相対的・絶対的absolute絶対的（absolute）absolute（絶対的）の両方で決定できる：

様式	内容
相対的	DNAを互いに比較——両者の違いを同定するのが目的（例：組織内の腫瘍細胞の同定、定性的）
絶対的absolute絶対的（absolute）absolute（絶対的）	DNA鋳型の定量的決定——分子・グラム単位での正確な数を同定（定量的）

応用： 遺伝子発現解析、「遺伝子量gene dosage遺伝子量（gene dosage）gene dosage（遺伝子量）」・CNV（コピー数変異copy number variation, CNVコピー数変異（copy number variation, CNV）copy number variation, CNV（コピー数変異））解析（大規模genome mutation大規模（genome mutation）genome mutation（大規模）反復変異）、SNPジェノタイピングgenotypingジェノタイピング（genotyping）genotyping（ジェノタイピング）、新規多型の同定（「融解曲線解析、melting curve analysis」）。

まとめ

PCRは変性（95℃、H結合切断）→アニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）（55℃前後、プライマー結合）→伸長（72℃、Taqポリメラーゼによる新鎖合成）という3段階の熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）をn回繰り返し、DNAを2ⁿ倍に指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）に増幅する。
新規合成鎖は指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）に増加する一方、元の長い鋳型鎖は直線的にしか増加しないという非対称性が、PCR産物の大部分を「望む長さの断片」に収束させる。
ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）はDNAをサイズ（負電荷・孔径pore size孔径（pore size）pore size（孔径）による移動度mobility移動度（mobility）mobility（移動度）の違い）で分離する検出手段であり、遺伝子変異・多型の同定、感染症診断、法医学forensic medicine法医学（forensic medicine）forensic medicine（法医学）、遺伝子発現解析など幅広く応用される。
リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）は蛍光レポーターにより増幅を反応進行中に定量し、相対的（比較）・絶対的absolute絶対的（absolute）absolute（絶対的）（分子数の正確な決定）の両様式で遺伝子発現解析やCNV解析、SNPジェノタイピングgenotypingジェノタイピング（genotyping）genotyping（ジェノタイピング）に用いられる。