Molecular Cell Biology · 19

組換えDNAの作製と応用、レポーターベクターと発現ベクター

Generation and application of recombinant DNA, reporter- and expression vectors

🧠 組換えDNA技術は「ベクター（運び手）＋インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）（積み荷）」という単純な組み合わせを、制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）の非対称切断による「粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端）」が正確な向きでの連結を保証することで実現している。レポーターベクターは「プロモーターの強さを光の量として読む」変換装置、発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）は「宿主細胞をタンパク質工場factories工場（factories）factories（工場）に変える」実装装置——同じベクター骨格の上に異なる目的（測定 vs 生産）を載せた2つの応用形である。

組換えDNA（recombinant DNA, rDNA）とは

組換えDNA分子は、遺伝的組換え（分子クローニングmolecular cloning分子クローニング（molecular cloning）molecular cloning（分子クローニング）など）の実験室的手法により、複数の由来から遺伝物質hereditary material遺伝物質（hereditary material）hereditary material（遺伝物質）を組み合わせて形成されたDNA分子であり、通常はゲノム中に見られない配列を作り出す。

組換えDNA＝インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）DNA＋ベクターDNA→別の細胞にタンパク質を産生させる

クローニングベクター

ウイルスまたはプラスミド（naturally occurring な細菌の染色体外・自己複製性・環状二本鎖DNAcircular double-stranded DNA環状二本鎖DNA（circular double-stranded DNA）circular double-stranded DNA（環状二本鎖DNA）分子）から取られた小さな環状DNA片で、細胞外で維持・複製可能であり、クローニングcloningクローニング（cloning）cloning（クローニング）目的で外来DNA断片（インサートinsertインサート（insert）insert（インサート））を挿入できる。

ベクターの機能に必要な4つのDNAセグメント：

セグメント	機能
複製起点ori複製起点（ori）ori（複製起点）	宿主細胞内でのベクター＋インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）の複製を保証する
マルチクローニングサイトmultiple cloning site (MCS)マルチクローニングサイト（multiple cloning site (MCS)）multiple cloning site (MCS)（マルチクローニングサイト）	制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）部位——プラスミドを開きインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）を導入する部位として機能する
選択マーカー（amp^R）	細菌に抗生物質antibiotics抗生物質（antibiotics）antibiotics（抗生物質）耐性を与える選択マーカー遺伝子。アンピシリン（β-ラクタム系抗生物質antibiotics抗生物質（antibiotics）antibiotics（抗生物質））は翻訳装置を破壊する
タグ遺伝子	インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）/外来DNAを含む細胞をスクリーニングするために使用できる（例：ルシフェラーゼluciferaseルシフェラーゼ（luciferase）luciferase（ルシフェラーゼ））

インサート

ベクターへ挿入される目的配列（遺伝子）で、目的タンパク質をコードする。インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）は通常PCR反応により増幅される。

分子クローニング

組換えDNA＝インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）DNA＋ベクターDNA→別の細胞にタンパク質を産生させる

適切なベクターを見つける
インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）を準備する→タンパク質をコード
ライゲーションligationライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション）（連結）： 制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）で両端を適合させる
形質転換： 組換えDNAを細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）へ導入する
コロニースクリーニングcolony screeningコロニースクリーニング（colony screening）colony screening（コロニースクリーニング）

段階3：ライゲーション

ベクターとインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）の両方が揃ったら、インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）を挿入するためベクターに切れ込みを入れる必要がある。ベクターの環状二本鎖DNAcircular double-stranded DNA環状二本鎖DNA（circular double-stranded DNA）circular double-stranded DNA（環状二本鎖DNA）を特定部位で切断する2種の異なる制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）を用いる。制限部位は通常短い回文配列palindromic sequence回文配列（palindromic sequence）palindromic sequence（回文配列）であり、両鎖が切断され遊離3′-OHと5′-OH基が生成される。

2本の鎖が非対称に切断されることが重要である——これによりベクター中の切断DNAの粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端）（異なる長さの切断）が互いに相補的にならないようにする
ベクターを切断するのと同じ制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）がインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）（標的DNA）も切断する
ライゲーションligationライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション）： 切断されたベクターとインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）をDNAリガーゼligaseリガーゼ（ligase）ligase（リガーゼ）の存在下で混合すると、ホスホジエステル結合phosphodiester bondホスホジエステル結合（phosphodiester bond）phosphodiester bond（ホスホジエステル結合）によりDNA断片の末端を共有結合的に連結する（ATPを要する反応）→組換えDNAが形成される

段階4：形質転換

組換えDNAを作製した後、ベクター-インサートinsertインサート（insert）insert（インサート）構築物を宿主細胞（コンピテントcompetent (cell, as in transformation)コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント）細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞））へ、化学的または電気的方法で導入できる。

方法	内容
化学的方法	組換えDNAとともに細胞をCa²⁺イオン存在下で氷上インキュベート→細胞膜に孔を形成→熱ショック（42℃、45秒）＝DNAが細胞内へ入る
電気的方法	細菌（細胞）を高電圧high高電圧（high）high（高電圧）・短時間の電気で処理→DNAが細胞内へ入ることを可能にする

組換えDNAが真核細胞eukaryote真核細胞（eukaryote）eukaryote（真核細胞）へ入る手順は「トランスフェクションtransfectionトランスフェクション（transfection）transfection（トランスフェクション）」と呼ばれる（ウイルス様粒子virus-like particle, VLPウイルス様粒子（virus-like particle, VLP）virus-like particle, VLP（ウイルス様粒子）を用い、ウイルス感染に似た過程でカプセル化されたDNAを細胞に導入する）。

段階5：コロニースクリーニング

組換えDNAを含む細胞は液体増殖培地の細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）に置かれる→外来DNAのタンパク質合成を促進する。細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）のコロニーは急速に分裂し、組換えタンパク質が大量に合成される。

産生させたいタンパク質はその後アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）によって精製purification精製（purification）purification（精製）できる（タンパク質の分離）。固定相は標的タンパク質に強く結合する性質（例：リガンド結合ligand bindingリガンド結合（ligand binding）ligand binding（リガンド結合）、抗体-抗原相互作用）を持ち、他の物質には弱くしか結合しないため、緩衝液で洗浄除去できる。

組換えDNAの応用

インスリンは組換え技術によって生成された最初の医薬品である。治療用のヒト成長ホルモンhuman growth hormone (hGH)ヒト成長ホルモン（human growth hormone (hGH)）human growth hormone (hGH)（ヒト成長ホルモン）も組換えDNAにより作られる。

遺伝子治療： 機能を欠く細胞に機能的遺伝子を供給する
組換えタンパク質の産生： クローン化された遺伝子がコードするタンパク質の産生——例えば医療用途で欠損した血液凝固因子など

レポーター遺伝子（ベクター）

レポーター遺伝子は、細胞に挿入されたDNA構築物の一部であることが多い遺伝子である。

これらのベクターは調節領域の解析に用いられる
特定の遺伝子がレポーターとして選ばれるのは、それを発現する生物に付与する特性が容易に同定・測定できるため——または選択マーカーであるため
レポーター遺伝子は、ある遺伝子が細胞/生物集団に取り込まれた/発現したかどうかの指標としてよく用いられる（例：pGL3ベクター）
レポーター遺伝子を用いることで、DNA構築物を導入した細胞内での産物の濃度/量を精密に測定できる
例：ルシフェラーゼluciferaseルシフェラーゼ（luciferase）luciferase（ルシフェラーゼ）遺伝子——発光を産生する→光強度が高い＝転写活性transcriptional activity転写活性（transcriptional activity）transcriptional activity（転写活性）が高い（強いプロモーター）

発現ベクター

発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）は、標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）/生物内での遺伝子のmRNA・タンパク質への実際の発現に関連する。

発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）はエンハンサーenhancerエンハンサー（enhancer）enhancer（エンハンサー）・プロモーター領域として機能する調節配列regulatory sequence調節配列（regulatory sequence）regulatory sequence（調節配列）を含み、遺伝子の効率的な転写を導く
ベクターは遺伝子発現に必要な要素を持たなければならない：プロモーター、正しい翻訳開始translation initiation翻訳開始（translation initiation）translation initiation（翻訳開始）配列（リボソーム結合部位ribosome binding siteリボソーム結合部位（ribosome binding site）ribosome binding site（リボソーム結合部位）、開始コドンstart codon開始コドン（start codon）start codon（開始コドン））、終結コドン、転写終結配列
よく設計された発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）の目標は効率的なタンパク質産生であり、これは安定なmRNAを大量に産生すること→それが翻訳されタンパク質になることで達成される
発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）の例：pcDNA 3.1——哺乳類mammal哺乳類（mammal）mammal（哺乳類）発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）

flowchart TD
  A["ベクター準備：ORI+MCS+選択マーカー+タグ遺伝子"] --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>で非対称切断→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sticky end'>粘着末端</span>形成"]
  B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='insert'>インサート</span>準備：PCRで目的遺伝子を増幅"] --> C
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligation'>ライゲーション</span>：DNA<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligase'>リガーゼ</span>が末端を共有結合的に連結"]
  D --> E["形質転換：化学的（Ca2+/熱ショック）または電気的に<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competent (cell, as in transformation)'>コンピテント</span>細菌へ導入"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='colony screening'>コロニースクリーニング</span>：液体培養で組換えタンパク質を大量産生"]
  F --> G["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='affinity chromatography'>アフィニティークロマトグラフィー</span>で目的タンパク質を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='purification'>精製</span>"]

まとめ

組換えDNAはベクター（ORI・MCS・選択マーカー・タグ遺伝子を持つ環状DNA）とインサートinsertインサート（insert）insert（インサート）（PCR増幅された目的遺伝子）を制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）による非対称切断（粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端））とDNAリガーゼligaseリガーゼ（ligase）ligase（リガーゼ）によるライゲーションligationライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション）で結合して作られる。
形質転換（化学的または電気的）により組換えDNAが宿主細胞へ導入され、コロニースクリーニングcolony screeningコロニースクリーニング（colony screening）colony screening（コロニースクリーニング）とアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）により目的タンパク質が産生・精製purification精製（purification）purification（精製）される。
組換えDNA技術はインスリン・hGHなどの医薬品生産industrial-scale pharmaceutical production医薬品生産（industrial-scale pharmaceutical production）industrial-scale pharmaceutical production（医薬品生産）、遺伝子治療、組換えタンパク質産生に応用される。
レポーターベクター（ルシフェラーゼluciferaseルシフェラーゼ（luciferase）luciferase（ルシフェラーゼ）等）はプロモーター強度を測定可能なシグナル（発光量）に変換し、発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）（pcDNA3.1等）は標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）での効率的なタンパク質産生を目的とした調節配列regulatory sequence調節配列（regulatory sequence）regulatory sequence（調節配列）一式を備える。