遺伝子変異と多型の検査法（RFLP、アレル特異的PCR、DNAシークエンシング、プライマー伸長法）

🧠 点変異・SNPの検出における中心課題は「長さが同じ2つのアレルを、どうやって見分けられる別々のPCR産物に変換するか」である。 RFLPは制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）の認識部位そのものを壊す/保つという性質を利用し、アレル特異的PCRはプライマー3′末端の相補性complementation相補性（complementation）complementation（相補性）の有無（プロファイリード活性の有無）を利用する——手法は違えど、いずれも「配列の違いを長さ/有無の違いへ変換する」という同じ発想を実装している。

背景：長さ多型と点変異の違い

異なるアレルが異なる長さのPCR産物を生成するなら、患者にどちらのアレル（罹患型・健常型）が存在するかを判別できる。

• 長さ多型： 様々なアレルが単に長さだけ異なる
• 点変異/SNP： 様々なアレルの長さは同一——では、異なるアレルをどうやって異なるサイズのPCR産物へ変換するか？→複数の方法が存在する（PCR産物のサイズ・組成・化学的性質等を変化させる）

RFLP

RFLPは相同DNA配列の変異を利用する技術である。RFLP解析では、DNA試料を断片化fragmentation断片化（fragmentation）fragmentation（断片化）し制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）で消化し、生じた制限断片をゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）によりその長さに応じて分離する。これは遺伝性疾患の遺伝子座の局在化や疾患リスクの判定に応用できる。RFLPは個体の遺伝子型の決定にも使用できる。

• RFLPは基本的に制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）（天然の細菌酵素で、特異的認識部位でDNAを結合・切断する酵素）の利用に基づく——2つのアレルを区別する
• 制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）はDNA二重らせんdouble helix二重らせん（double helix）double helix（二重らせん）中の4〜8 bp長の回文配列palindromic sequence回文配列（palindromic sequence）palindromic sequence（回文配列）を認識し、ホスホジエステル結合phosphodiester bondホスホジエステル結合（phosphodiester bond）phosphodiester bond（ホスホジエステル結合）の加水分解により両鎖を切断する
  • 粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端）＝長さの異なる切断
  • 平滑末端blunt end平滑末端（blunt end）blunt end（平滑末端）＝同じ長さの切断
• SNVを含まない配列は認識部位を生成する→断片が切断される（図中のTアレル）
• SNVを含む配列は認識部位を破壊する→断片が切断されない（Cアレル）

→ どちらのアレルが切断され、どちらが切断されないかを認識した後、ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）により両者を容易に分離できる。

手順： 第1段階：領域を増幅→第2段階：RFLP（制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）消化）→第3段階：ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）

アレル特異的PCR

アレル特異的プライマーに基づく技術で、SNPを効果的に解析するために使用できる。

2つの別々の反応混合物reaction mixture反応混合物（reaction mixture）reaction mixture（反応混合物）を用いる：

• プライマーは①一方のアレルに相補的、または②他方のアレルに相補的なものが作成される
• プライマーは多型部位に正確にアニールし、完全に相補的であれば→DNAポリメラーゼにとって完璧な開始点となる＝鎖の合成が開始する
• プライマーが完全に相補的でない場合＝DNAポリメラーゼは合成を開始できない＝DNAポリメラーゼは停止する

このタイプのPCRでは3種のプライマーが用いられる（外側の共通プライマー2種＋アレル特異的プライマー）。

⭐ 想起retrieval想起（retrieval）retrieval（想起）：

• 3′-エキソヌクレアーゼ活性exonuclease activityエキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity）exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性）＝校正proofreading校正（proofreading）proofreading（校正）： 複製の高い正確性を担う。酵素は最後に付加されたヌクレオチドが誤っていないかを認識する
• 5′-エキソヌクレアーゼ活性exonuclease activityエキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity）exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性）： 酵素前方の岡崎フラグメントOkazaki fragment岡崎フラグメント（Okazaki fragment）Okazaki fragment（岡崎フラグメント）の除去を助ける（05-principles-of-the-semiconservative-dna-replication-replication-fork-leading-and参照）

DNAシークエンシング：サンガー法

DNAシークエンシングとは、DNA分子内のヌクレオチドの正確な順序を決定する過程である。DNA鎖中の4つの塩基（A、G、C、T）の順序を決定するために使われる任意の方法/技術を含む。

サンガーシークエンシングSanger sequencingサンガーシークエンシング（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガーシークエンシング）： 鎖終結法chain-termination method鎖終結法（chain-termination method）chain-termination method（鎖終結法）であり、ssDNA鋳型、DNAプライマー、DNAポリメラーゼ、通常のデオキシヌクレオチドdeoxynucleotide (dNTP)デオキシヌクレオチド（deoxynucleotide (dNTP)）deoxynucleotide (dNTP)（デオキシヌクレオチド）、および修飾ジデオキシヌクレオチドdideoxynucleotide (ddNTP)ジデオキシヌクレオチド（dideoxynucleotide (ddNTP)）dideoxynucleotide (ddNTP)（ジデオキシヌクレオチド）を必要とする。

• ddNTPはDNA鎖の伸長を終結させる——これらのヌクレオチドはホスホジエステルphosphodiesterホスホジエステル（phosphodiester）phosphodiester（ホスホジエステル）骨格の生成に必要な3′-OH基を欠くため→DNAポリメラーゼが伸長を継続できなくなる
• ddNTPにより終結したssDNAの長さを元の鎖と比較することで、塩基の位置を特定できる

方法： 4つの塩基の位置を決定するため4つの反応混合物reaction mixture反応混合物（reaction mixture）reaction mixture（反応混合物）が用意される。これらにはDNA鋳型とプライマー、4種の天然ヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、そして1種の非天然ddNTPが加えられる。

• プライマーは通常放射性標識されており、ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）で断片を可視化できる
• 修飾ddNTPが取り込まれると、DNAポリメラーゼのDNA伸長が停止する
• 異なる断片はゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）で分離できる——小さな断片ほど速く移動する→4塩基の位置を決定できる

プライマー伸長法

• 転写開始transcription initiation転写開始（transcription initiation）transcription initiation（転写開始）部位を決定するために使用される
• 遺伝子の3′端付近の領域に相補的な放射性標識プライマーを必要とする
• プライマーをRNAへアニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）させ、逆転写酵素を用いてRNAの5′端に達するまでcDNA（相補的DNA）を合成する
• 産物をポリアクリルアミドゲルで泳動することで転写開始transcription initiation転写開始（transcription initiation）transcription initiation（転写開始）部位を決定できる——ゲル上の配列長が開始部位から放射性標識プライマーまでの距離を表すため

⭐ 基本的な考え方： 異なる蛍光で標識したプライマーを用いて、どのプライマーが変異点に結合するかを見ることで、その部位にどの塩基があるかを判定できる。

flowchart TD
  A["同じ長さの2アレル（点変異/SNP）"] --> B["RFLP：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>認識部位の有無で切断可否が変わる→断片長の違いへ変換"]
  A --> C["アレル特異的PCR：プライマー3'端の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complementation'>相補性</span>の有無→伸長の有無へ変換"]
  A --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Sanger sequencing'>サンガーシークエンシング</span>：ddNTP取り込みによる<span class='jp-term jp-term-diagram' title='chain termination'>鎖終結</span>位置→塩基配列そのものを決定"]
  A --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primer extension'>プライマー伸長法</span>：cDNA合成の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='endpoint'>終点</span>→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='transcription initiation'>転写開始</span>部位/変異部位の塩基を決定"]

まとめ

• 長さ多型は電気泳動でそのまま区別できるが、点変異/SNPは長さが同一であるため、配列の違いを長さ・有無の違いへ変換する追加の手法が必要となる。
• RFLPは制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）認識部位がSNVにより破壊される/保たれるかを利用し、断片長の違いとして多型を可視化する。
• アレル特異的PCRはプライマー3′末端の相補性complementation相補性（complementation）complementation（相補性）の有無を利用し、完全一致のみDNAポリメラーゼが伸長を開始できる原理でアレルを判別する。
• サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法）はddNTPによる鎖終結chain termination鎖終結（chain termination）chain termination（鎖終結）（3′-OH欠如）を利用して塩基配列そのものを決定し、プライマー伸長法primer extensionプライマー伸長法（primer extension）primer extension（プライマー伸長法）は放射性標識プライマーからのcDNA合成距離により転写開始transcription initiation転写開始（transcription initiation）transcription initiation（転写開始）部位や変異部位の塩基を特定する。