Molecular Cell Biology · 78

PCR-RFLPによるTAS2R38味覚受容体の遺伝子型判定

Genotyping of the TAS2R38 tasting receptor by PCR-RFLP

🧠 PCR-RFLPの核心は「配列の違いを長さの違いに変換する」という1つの発想である——制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）Fnu4HIはT対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子（PAV、味を感じる）を切断できないがC対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子（AVI、味を感じない）を切断できる。 SNPという1塩基の違いそのものは電気泳動では見えないが、この1塩基が制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）の認識配列を作るか壊すかによって「切れる/切れない」という物理的な長さの差に変換されれば、アガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）という単純なサイズ分離技術だけで遺伝子型を読み取れるようになる——分子生物学における「見えないものを見えるものに変換する」という手法の典型例である。

TAS2R38遺伝子の背景

TAS2R38遺伝子には3つのSNP＝多型の影響を受ける3つのヌクレオチド（ミスセンス変異missense mutationミスセンス変異（missense mutation）missense mutation（ミスセンス変異））がある：

優性の「T」アレルは、可変位置にプロリンprolineプロリン（proline）proline（プロリン）-アラニンalanineアラニン（alanine）alanine（アラニン）-バリンvalineバリン（valine）valine（バリン）のアミノ酸を含むPAVアレル変異体allelic variantアレル変異体（allelic variant）allelic variant（アレル変異体）をコードする→この受容体はPTCに感受性がある
劣性の「t」アレルは、アラニンalanineアラニン（alanine）alanine（アラニン）-バリンvalineバリン（valine）valine（バリン）-イソロイシンisoleucine (Ile)イソロイシン（isoleucine (Ile)）isoleucine (Ile)（イソロイシン）を含むAVI変異体をコードする→この受容体はPTC非感受性である

3つの遺伝子型変異が表現型を決定しうる：

TTホモ接合（2×PAV）＝味を感じる（taster）
Ttヘテロ接合heterozygousヘテロ接合（heterozygous）heterozygous（ヘテロ接合）＝味を感じる
ttホモ接合（2×AVI）＝味を感じない（non-taster）

1. 頬粘膜細胞からのゲノムDNAの単離

ゲノムDNAは、綿棒cotton swab綿棒（cotton swab）cotton swab（綿棒）を用いて頬の内側表面/歯茎の外側表面をこすることで調製される
頬綿棒cotton swab綿棒（cotton swab）cotton swab（綿棒）の綿部分を切り取る→エッペンドルフチューブtubeチューブ（tube）tube（チューブ）に入れPBS（リン酸緩衝生理食塩水saline生理食塩水（saline）saline（生理食塩水））を加える
プロテイナーゼKを加える→DNAを破壊するであろう酵素（エキソ＋エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ））を破壊する
ゲノム溶解/結合緩衝液を加える→細胞膜を除去するのを助ける
ボルテックスし55度でインキュベートする（プロテイナーゼKの至適温度）

ゲノムDNAは細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）物からアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）を用いて単離される。DNAアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）の原理は、プラスチックplasticプラスチック（plastic）plastic（プラスチック）シリンダー内に封入された陽イオン性cationic陽イオン性（cationic）cationic（陽イオン性）マトリックスが負に帯電した核酸に高い親和性で結合する一方、細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）物の他の成分はマトリックス表面に結合しない/弱くしか結合しないというものである。3つの段階：①吸着（結合）： DNAがゲル表面に結合する　②洗浄： 適切な緩衝液を用いて弱く結合した不純物を洗い流す　③溶出： アルカリ性緩衝液でDNAを回収する。

2. PCR反応の設定——DNA増幅

ポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）の熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）は3つの段階に分けられる：

変性： 二本鎖DNAが95度で加熱・変性され一本鎖鋳型が得られる
アニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）： 配列特異的な一本鎖DNAsingle-stranded DNA一本鎖DNA（single-stranded DNA）single-stranded DNA（一本鎖DNA）プライマーが、より低温（55度）で鋳型DNAにハイブリダイズし、増幅される領域の境界を定める
伸長： プライマーの伸長は72度で起こる→DNAポリメラーゼが最もよく働く温度

→ 初期変性：95〜98度。

この熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）は40回繰り返される。PCR産物の量は各サイクルで倍加するため、約40サイクル→2の40乗＝電気泳動には多量のDNAが必要である。

DNAポリメラーゼは相補鎖（コード鎖）の合成を単独で開始できないため、伸長を触媒できるよう遊離の3’-OH末端を持つプライマーが必要である。

PCR混合液の構成成分： DNA鋳型、DNAポリメラーゼ、2種のプライマー（フォワードとリバース）、ヌクレオチド、緩衝液。

3. 制限酵素消化（RFLP＝制限酵素断片長多型）

2つのアレルを区別するため制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）消化を行う。制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）は一方のアレルを配列特異的に切断するが、単一塩基の変異を含むもう一方の配列は認識しない。一方のアレル変異体allelic variantアレル変異体（allelic variant）allelic variant（アレル変異体）のPCR産物は切断されて2つのより短い断片を生じ、配列多型を長さの差へ変換する——これはゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）により可視化できる。

制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）は、DNA二重らせんdouble helix二重らせん（double helix）double helix（二重らせん）中の4〜8塩基対base pairing塩基対（base pairing）base pairing（塩基対）長の回文配列palindromic sequence回文配列（palindromic sequence）palindromic sequence（回文配列）を認識し、ホスホジエステル結合phosphodiester bondホスホジエステル結合（phosphodiester bond）phosphodiester bond（ホスホジエステル結合）の加水分解により両鎖を切断する。粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端）＝ 長さの異なる切断、平滑末端blunt end平滑末端（blunt end）blunt end（平滑末端）＝ 長さの同じ切断。

TAS2R38の遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）にはFnu4HI制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）が用いられる：

→ PTC感受性アレルはCヌクレオチドを含む → 味を感じない表現型はT遺伝子型に対応し、この酵素により切断できない → 制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）消化は37度で1時間行われる

アレル	制限断片
Tアレル（SNP部位P siteP部位（P site）P site（P部位）で切断されない）	406 bp、21 bp、41 bp
Cアレル（切断される）	331 bp、75 bp、21 bp、41 bp

（元のPCR産物は468 bp）

flowchart TD
  A["468 bp PCR産物（SNP位置C/T）"] --> B["Fnu4HI<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>消化（GCNGC認識配列）"]
  B --> C["Tアレル：SN<span class='jp-term jp-term-diagram' title='P site'>P部位</span>で切断されず406bp+21bp+41bp"]
  B --> D["Cアレル：SN<span class='jp-term jp-term-diagram' title='P site'>P部位</span>で切断され331bp+75bp+21bp+41bp"]

4. アガロースゲル電気泳動

DNA断片はアガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）により分離・可視化される
アガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）は海藻から単離される多糖であり、その鎖は容易に水和hydration水和（hydration）hydration（水和）し、多数の孔を持つ非晶質ゲルを形成し分子ふるいmolecular sieving分子ふるい（molecular sieving）molecular sieving（分子ふるい）として機能できる
分離はサイズのみに基づく→最小の断片が最も遠くまで（正極へ）移動し、最大の断片は最も近く（負極付近）に留まる
ローディング緩衝液（グリセロール、ブロモフェノールphenolフェノール（phenol）phenol（フェノール）ブルー、キシレンxyleneキシレン（xylene）xylene（キシレン）シアノールからなる）を消化産物digestion products消化産物（digestion products）digestion products（消化産物）に加える
消化産物digestion products消化産物（digestion products）digestion products（消化産物）の概算サイズ（分子量）を決定するため、DNAラダー（分子量マーカー）もゲルの別レーンで泳動される→DNAマーカーは異なる分子量を持つ10のDNA断片を含む
泳動過程は120Vで約30分かかる
電気泳動分離後、ゲルスラブはUVランプにより透過照明される

→ TTホモ接合遺伝子型（味を感じない表現型）の場合、アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）は制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）により切断されない。切断されていない303bpのバンドが300bpマーカーバンドと同じ高さに見られる → CCホモ接合体homozygoteホモ接合体（homozygote）homozygote（ホモ接合体）（味を感じる表現型）は239 bpと64 bpの分子量を持つ2つの制限断片を産生する → CTヘテロ接合体heterozygoteヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体）（優性アレルの存在により味を感じる表現型）の場合、303 bpと239 bpの両方の断片が見られる

まとめ

TAS2R38遺伝子の3つのSNPはPAV（優性、PTC感受性）とAVI（劣性、PTC非感受性）というハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）を規定し、遺伝子型（TT/Tt/tt）によって味を感じる/感じない表現型が決まる。
実験は頬粘膜buccal mucosa頬粘膜（buccal mucosa）buccal mucosa（頬粘膜）細胞からのゲノムDNA単離（アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー））、PCR増幅（変性・アニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）・伸長の熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル））、制限酵素Fnu4HI制限酵素（Fnu4HI）Fnu4HI（制限酵素）消化によるRFLP解析、アガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）による断片サイズの可視化という4段階からなる。
Fnu4HIはC対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子（PTC感受性）を切断できるがT対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子（非感受性）は切断できないため、SNPという配列レベルの違いを電気泳動で読み取れる長さの違いへと変換し、遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）を可能にする。