分子生物学におけるin silicoツール

🧠 この単元は「遺伝的多様性の分類」と「その分類を実際に検証するin silicoワークフロー」という2つの層からなる。 分類の軸は2つ——単一遺伝子か多数の遺伝子・環境要因が絡むか（単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患） vs 多因子疾患polygenic, complex/multifactorial disease多因子疾患（polygenic, complex/multifactorial disease）polygenic, complex/multifactorial disease（多因子疾患））、そして塩基配列の変化が「置換」か「長さの変化」か（SNV vs 長さ多型）。そして後半のPTC苦味bitter taste苦味（bitter taste）bitter taste（苦味）受容体の実験は、この分類論を実地に動かす実演であり、OMIM→NCBI→NEBcutter→Primer-BLASTLower Anogenital Squamous TerminologyLAST（Lower Anogenital Squamous Terminology）Lower Anogenital Squamous Terminology（LAST）という4つのデータベース/ツールを順に通すことで、「遺伝子を知る→配列を知る→制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）部位を知る→プライマーを設計する」という一直線のin silicoパイプラインを体現している。

in silico手法とは

in silico手法とは、コンピュータベースの探索を介して行われる手法を指す。この手法には以下が含まれる：

• コンピュータ化されたデータベースでの検索
• コンピュータベースの設計
• 化学的・生化学的反応のモデリングとシミュレーション
• シグナル伝達、細胞の成長・分裂・分化を統括する分子ネットワークなどの生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）細胞過程

→ これらを総合すると、in silico手法は医療実践だけでなく基礎/応用生物医学研究の両方にとって不可欠なものとなっている。

遺伝的変異と疾患の分類

一般的な個体差individual variation個体差（individual variation）individual variation（個体差）は主に遺伝的変異genetic variation遺伝的変異（genetic variation）genetic variation（遺伝的変異）——すなわちヒトゲノムにおける多型と変異——に起因する。形質や疾患はこれら個体間の遺伝的変異genetic variation遺伝的変異（genetic variation）genetic variation（遺伝的変異）に帰せられる：

変異の型：SNVと長さ多型

SNV（single nucleotide variation、単一ヌクレオチド変異）： ゲノム中の1つのヌクレオチドが変化すること

• SNP（single nucleotide polymorphism、一塩基多型single-nucleotide polymorphisms, SNP一塩基多型（single-nucleotide polymorphisms, SNP）single-nucleotide polymorphisms, SNP（一塩基多型））： 集団の1%超に見られる
• 点変異（置換、欠失、挿入）：集団の1%未満に見られる

長さ多型：（長さが異なる）

• マイクロサテライトmicrosatelliteマイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト）（短鎖縦列反復short tandem repeat (STR)短鎖縦列反復（short tandem repeat (STR)）short tandem repeat (STR)（短鎖縦列反復）、2〜10bp）
• ミニサテライトminisatelliteミニサテライト（minisatellite）minisatellite（ミニサテライト）（可変数variables変数（variables）variables（変数）縦列反復＝VNTR、10〜1000bp）

💡 コーディング領域内でのSNP/点変異の効果には様々な段階がありうる——61のコドンが20種のアミノ酸を指定するため「何も変化しない（同義置換synonymous同義置換（synonymous）synonymous（同義置換））」場合もあれば、アミノ酸1つの変化、誤ったスプライシング、「ナンセンスnonsense (mutation)ナンセンス（nonsense (mutation)）nonsense (mutation)（ナンセンス）」変異（アミノ酸→終止コドンstop codon終止コドン（stop codon）stop codon（終止コドン）、タンパク質末端の欠損）が生じることもある。長さ変異では、塩基対base pairing塩基対（base pairing）base pairing（塩基対）数が3nならnアミノ酸分の変化にとどまるが、3n+1または3n+2であれば「フレームシフトframeshiftフレームシフト（frameshift）frameshift（フレームシフト）」変異となり下流全体が読み枠reading frame読み枠（reading frame）reading frame（読み枠）のずれによって破綻する（分子細胞生物学 10：点突然変異の種類と発生機序参照）。

実験：TAS2R38苦味受容体のPTC感受性SNPの遺伝子型判定

実験の目的は、天然に存在する化合物であるフェニルチオカルバミドphenylthiocarbamide (PTC)フェニルチオカルバミド（phenylthiocarbamide (PTC)）phenylthiocarbamide (PTC)（フェニルチオカルバミド）の苦味bitter taste苦味（bitter taste）bitter taste（苦味）感受性に決定的に関与する自身のSNPを遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）することである。TAS2R38遺伝子は苦味bitter taste苦味（bitter taste）bitter taste（苦味）感受性に決定的な3つのSNPを持つ。

in silico手法の利用

• OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）は、PTCに感受性の遺伝子（TAS2R38）を見つけることができるデータベースである
• NCBIヌクレオチドデータベースも用いて、両ハプロタイプhaplotypeハプロタイプ（haplotype）haplotype（ハプロタイプ）によりコードされるアミノ酸配列amino-acid sequenceアミノ酸配列（amino-acid sequence）amino-acid sequence（アミノ酸配列）を決定する
• SNPを含むゲノム配列はポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅される
• PCR-RFLPによりSNPを解析する→NEBcutterにより適切な制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）を選択する→NCBI Primer-BLASTLower Anogenital Squamous TerminologyLAST（Lower Anogenital Squamous Terminology）Lower Anogenital Squamous Terminology（LAST）によりフォワード・リバースプライマーを設計する

実験の段階

1. セッション1：in silico設計
   1. 形質（PTC感受性）→OMIMデータベース
   2. 遺伝子→NCBI gene、dbSNP
   3. RFLP→NEBcutter
   4. PCR→NCBI Primer-BLAST
2. セッション2： PTCの味わい（「表現型判定」）、DNA単離とPCR
3. セッション3： PCR産物の消化、ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）→「遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）」

flowchart TD
  A["形質（PTC感受性）を確認"] --> B["OMIMデータベースで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='causative gene'>原因遺伝子</span>を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='TAS2R38'>検索</span>"]
  B --> C["NCBI gene/dbSNPでSNPの位置と配列を確認"]
  C --> D["NEBcutterで適切な<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>を選択（RFLP用）"]
  D --> E["NCBI Primer-B<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Lower Anogenital Squamous Terminology'>LAST</span>でフォワード/リバースプライマーを設計"]
  E --> F["PCRによるゲノム配列の増幅"]
  F --> G["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>消化→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='gel electrophoresis'>ゲル電気泳動</span>による<span class='jp-term jp-term-diagram' title='genotyping'>遺伝子型判定</span>"]

まず、対象のSNPを包含するゲノム配列をポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）により増幅する→その後アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）を適切な制限エンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）で配列特異的に切断する→その後消化断片をアガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）により分離する（詳細は78-genotyping-of-the-tas2r38-tasting-receptor-by-pcr-rflp参照）。

まとめ

• 遺伝的多様性は単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）（1遺伝子座→1形質）と多因子疾患polygenic, complex/multifactorial disease多因子疾患（polygenic, complex/multifactorial disease）polygenic, complex/multifactorial disease（多因子疾患）（多数の遺伝子変異＋環境要因）に分類され、変異の型はSNV（SNP・点変異、塩基置換）と長さ多型（マイクロサテライトmicrosatelliteマイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト）・ミニサテライトminisatelliteミニサテライト（minisatellite）minisatellite（ミニサテライト））に分けられる。
• in silico手法（データベース検索、コンピュータベースの設計、モデリング/シミュレーション）は医療実践と生物医学研究の両方に不可欠であり、TAS2R38の苦味bitter taste苦味（bitter taste）bitter taste（苦味）感受性SNPの遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）実験はこれを具体的に実演する。
• 実験はOMIM（遺伝子の同定）→NCBI gene/dbSNP（配列確認）→NEBcutter（制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）選択）→NCBI Primer-BLASTLower Anogenital Squamous TerminologyLAST（Lower Anogenital Squamous Terminology）Lower Anogenital Squamous Terminology（LAST）（プライマー設計）という一連のin silicoツールを経て、PCR増幅・制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）消化・ゲル電気泳動gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動）による実際の遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）へとつながる。