アフィニティークロマトグラフィーによる細菌発現タンパク質の精製

🧠 アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）の核心は「ヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）残基がニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）イオンと配位結合coordinate bond配位結合（coordinate bond）coordinate bond（配位結合）を作る」という1つの化学的事実であり、この単元全体はその1点をどう使い倒すかというストーリーである。 6×Hisタグを持つ標的タンパク質だけがニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）樹脂に強く結合し、他の宿主タンパク質は洗い流される——そして溶出は「もっと強い結合」ではなく「イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）という競合分子を大量に投入して数で押し切る」という発想で行われる。20mMでは6×Hisタグの親和性に負けて洗浄液に留まり、500mMでは濃度差concentration difference濃度差（concentration difference）concentration difference（濃度差）で6×His-YFPを追い出す、という同じ試薬（イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール））の濃度だけを変えた2段階操作である点がこの精製purification精製（purification）purification（精製）法の巧妙さである。

組換えタンパク質産生の背景

人工的なDNA配列（組換えDNA）が適切なタンパク質過剰発現overexpression過剰発現（overexpression）overexpression（過剰発現）ベクターへ挿入される。ベクターは原核/真核宿主細胞へ導入され、組換えタンパク質の発現を誘導できる。

使用前に、標的タンパク質は宿主細胞の無用だが豊富な内因性タンパク質から分離されなければならない。タンパク質精製purification精製（purification）purification（精製）はアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）のような特殊なクロマトグラフィーchromatographyクロマトグラフィー（chromatography）chromatography（クロマトグラフィー）アッセイにより行われる——これは1段階で高純度purity純度（purity）purity（純度）の精製purification精製（purification）purification（精製）を達成するために用いられるツールである。したがって組換えタンパク質は、アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）の適用を可能にする短いアミノ酸配列amino-acid sequenceアミノ酸配列（amino-acid sequence）amino-acid sequence（アミノ酸配列）でタグ付けされることが多い。

実験

この実験の目的は、大腸菌細胞内で発現した黄色蛍光タンパク質yellow fluorescent protein (YFP)黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein (YFP)）yellow fluorescent protein (YFP)（黄色蛍光タンパク質）を精製purification精製（purification）purification（精製）することである。YFPはそのN末端に6つの連続したヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）残基（6×His）でタグ付けされており、アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）に基づく精製purification精製（purification）purification（精製）を可能にする。

誘導の成功はUV光による細胞懸濁液suspension懸濁液（suspension）suspension（懸濁液）の照射によって検出できる。誘導後、細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）は低速遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）段階により培養ブロスから分離できる。遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）により管の底に細菌ペレットが、上部に液体上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）が得られる。両相をUV光下で調べることで、誘導された細菌ペレットが最も強い蛍光を発することが観察できる。

6×His-YFPを複雑なマトリックスから分離するため、最初の作業は細胞を開くこと：(1)細胞壁と膜を破壊する細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）、続いて(2)アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）による標的タンパク質の単離。

1. 細胞溶解

溶解液の主成分main component主成分（main component）main component（主成分）：リン酸緩衝液、塩化ナトリウム、リゾチームlysozymeリゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム）、DNase。

• リン酸緩衝液は溶解に最適なpH（pH=8）を保証し、NaClは適切なイオン強度を提供し、リゾチームlysozymeリゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム）とDNase酵素が細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）を促進する
• 細胞壁と膜の破壊は染色体DNAの放出を引き起こす→懸濁液suspension懸濁液（suspension）suspension（懸濁液）の粘度を大幅に増加させる→溶解液に加えられたDNaseが全ての型のDNA＋RNAを分解し、溶液の粘度を低下させる
• 再懸濁後、細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）物は最大rpmで遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）され、より大きな細菌デブリdebrisデブリ（debris）debris（デブリ）（例：細胞膜、細胞壁断片）や不溶性粒子を管の底へ沈降させる一方、可溶性タンパク質（6×His-YFP）は上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）に残る
• この段階で、誘導された試料の上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）はUV下でより高い蛍光を示す。誘導された試料の上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）（溶解物）がアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）精製purification精製（purification）purification（精製）に用いられる

2. アフィニティークロマトグラフィー

クロマトグラフィーchromatographyクロマトグラフィー（chromatography）chromatography（クロマトグラフィー）はタンパク質の分離に用いられる。クロマトグラフィーchromatographyクロマトグラフィー（chromatography）chromatography（クロマトグラフィー）系は固定相（例：紙、ガラス、樹脂、ビーズ）と、固定相を通過する移動相（溶媒と分離される分子）を含む。固定相は通常カラムに詰められる。

アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）の場合、標的分子への高い親和性を持つリガンドと結合した固定相（ビーズ、樹脂）を用いる。リガンドは通常固相（例：アガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース）ビーズ）に固定化される。

精製purification精製（purification）purification（精製）の基盤は、ヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）アミノ酸残基amino acid residueアミノ酸残基（amino acid residue）amino acid residue（アミノ酸残基）がニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）と配位結合coordinate bond配位結合（coordinate bond）coordinate bond（配位結合）を形成できることである。樹脂（アガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース））に特異的に結合したタンパク質は、低pHグリシン緩衝液または競合物質（ヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）/イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール））により溶出できる。精製purification精製（purification）purification（精製）に用いるマイクロスピンspinスピン（spin）spin（スピン）カラムは、精製purification精製（purification）purification（精製）に用いるビーズを含むポリエチレンフィルターbarrierフィルター（barrier）barrier（フィルター）を含む。

flowchart TD
  A["結合：6xHis-YFPを含む溶解物を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nickel'>ニッケル</span>樹脂に通す"] --> B["6xHisが<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nickel'>ニッケル</span>に<span class='jp-term jp-term-diagram' title='coordinate bond'>配位結合</span>"]
  B --> C["洗浄：低濃度<span class='jp-term jp-term-diagram' title='imidazole'>イミダゾール</span>（20mM）で他のタンパク質を除去"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Elute'>溶出</span>：高濃度<span class='jp-term jp-term-diagram' title='imidazole'>イミダゾール</span>（500mM）で6xHis-YFPを<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competitive'>競合的</span>に追い出す"]
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='purification'>精製</span>された6xHis-YFPの回収"]

精製に用いる3種の溶液

1. 平衡化/溶解溶液（結合、Bind）： 溶解に用いたリゾチームlysozymeリゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム）とDNase酵素を除く溶解溶液の全成分を含み、Hisタグ付きタンパク質を類似の溶液内で結合させるためカラムを準備する
2. 洗浄溶液： 平衡化緩衝液と同じ成分を持つが、ビーズから特異的に結合していないタンパク質を除去するため低濃度のイミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）（20mM）を含む。イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）は6×Hisの競合物質として働くが、ニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）イオンへの親和性は6×Hisタグ付きタンパク質のそれより低いままである。6つのヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）のニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）イオンへの高い親和性のため、6×His-YFPは20mMイミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）濃度でもビーズに安定に結合し続ける
3. 溶出溶液： 平衡化緩衝液と同じ成分を持つが、高濃度のイミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）（500mM）を含む。ヘキサヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）タグのニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）イオンへの親和性はイミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）のそれよりはるかに高いが、高濃度により、ビーズに結合した6×His-YFPを競合的competitive競合的（competitive）competitive（競合的）に追い出すことができる。数分間のインキュベーション後、溶出された6×His-YFPはUV光下で管底の蛍光リングとして観察できる。

💡 洗浄段階と溶出段階は同じ試薬（イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール））の濃度だけを変えた操作である。 20mMでは6×Hisタグの圧倒的な親和性に負けてイミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）だけが洗い流され、500mMでは濃度差concentration difference濃度差（concentration difference）concentration difference（濃度差）（質量作用）によって6×His-YFPさえも競合的competitive競合的（competitive）competitive（競合的）に追い出される——「親和性の強さ」ではなく「濃度による数の力」で溶出を達成する点がアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）の実践的なコツである。

まとめ

• 組換えタンパク質産生では、目的タンパク質を短いアミノ酸タグ（例：6×His）でマークし、アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）により1段階で高純度purity純度（purity）purity（純度）に精製purification精製（purification）purification（精製）する。
• 細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）（リゾチームlysozymeリゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム）・DNase・リン酸緩衝液）により細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）を破壊し遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）で上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）に可溶性タンパク質を得た後、ヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）残基とニッケルnickelニッケル（nickel）nickel（ニッケル）イオンの配位結合coordinate bond配位結合（coordinate bond）coordinate bond（配位結合）を利用したアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）で標的タンパク質を樹脂に結合させる。
• 洗浄（低濃度イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）、20mM）では非特異的結合aspecific binding非特異的結合（aspecific binding）aspecific binding（非特異的結合）タンパク質のみが除去され、溶出（高濃度イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール）、500mM）では濃度差concentration difference濃度差（concentration difference）concentration difference（濃度差）により6×Hisタグ付き標的タンパク質自体が競合的competitive競合的（competitive）competitive（競合的）に追い出されて回収される。