原核生物における遺伝子発現の解析：大腸菌でのβ-ガラクトシダーゼの誘導

🧠 lacオペロンは4通りの入力（グルコース・ラクトースの有無）を1つの出力（オペロンON/OFF）へ変換する論理ゲートであり、その回路は「リプレッサーが常にオペレーターoperatorオペレーター（operator）operator（オペレーター）を塞いでいる」というデフォルトOFFの状態から出発する。 ラクトースの存在だけがリプレッサーを外し、グルコースの不在だけがCRP（CAP）を活性化してRNAポリメラーゼの結合を強化する——両方が揃って初めて「ON」になるANDゲートである。実験ではこのオペロンの働きをIPTG（分解されない誘導物質）とONPG（発色する人工基質）という2つの「トリック分子」で可視化し、リファンピシン（転写阻害）とクロラムフェニコールchloramphenicolクロラムフェニコール（chloramphenicol）chloramphenicol（クロラムフェニコール）（翻訳阻害typical翻訳阻害（typical）typical（翻訳阻害））という異なる標的を持つ2種の抗生物質antibiotics抗生物質（antibiotics）antibiotics（抗生物質）で、誘導のどの段階が阻害されているかを切り分ける。

プロモーターの強弱

強いプロモーター： 開始が毎時間起こる——コンセンサス配列が変化しておらず（進化的に）保存されているため。σ因子への親和性が高い＝RNAポリメラーゼの結合頻度が高い。

弱いプロモーター： 開始が週/月に1度起こる——コンセンサス配列が変化しているため。σ因子への親和性が低い＝結合頻度が低い。

構成的遺伝子と誘導性遺伝子

構成的遺伝子constitutive genes構成的遺伝子（constitutive genes）constitutive genes（構成的遺伝子）： ハウスキーピング遺伝子housekeeping geneハウスキーピング遺伝子（housekeeping gene）housekeeping gene（ハウスキーピング遺伝子）であり、常にONになっている。タンパク質は細胞により継続的に産生される。

誘導性遺伝子inducible gene誘導性遺伝子（inducible gene）inducible gene（誘導性遺伝子）： 常に活性であるわけではない。その働きは環境条件や外部刺激に依存し、これらは人工的に制御できる＝ON/OFFに切り替えられる。

→ リプレッサーまたはアクチベータータンパク質が特異的DNA配列を認識・結合し、近傍遺伝子の転写を制御する。

lacオペロン——負の誘導性調節

• ラクトース（二糖disaccharide二糖（disaccharide）disaccharide（二糖）：ガラクトースgalactoseガラクトース（galactose）galactose（ガラクトース）＋グルコース）の分解に必要な3つのタンパク質をコードする調節遺伝子regulator gene調節遺伝子（regulator gene）regulator gene（調節遺伝子）の配列である
• ヒトの消化管内の大腸菌に見出され、酵素β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）を産生する——これによりラクトースを分解できるようになる
• タンパク質のコード配列coding sequenceコード配列（coding sequence）coding sequence（コード配列）：LacZ（β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ））、LacY（ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）パーミアーゼpermeaseパーミアーゼ（permease）permease（パーミアーゼ））、LacA（ガラクトシドトランスアセチラーゼgalactoside transacetylaseガラクトシドトランスアセチラーゼ（galactoside transacetylase）galactoside transacetylase（ガラクトシドトランスアセチラーゼ））
  • LacI遺伝子はlacオペロンのリプレッサーを作る構成的遺伝子constitutive genes構成的遺伝子（constitutive genes）constitutive genes（構成的遺伝子）である——オペロン自体の一部ではない

このオペロンは通常OFFである——グルコース存在下では、大腸菌はラクトースを消化するこれらのタンパク質を産生するためにエネルギーと時間を無駄にしたくないためである。グルコース不在下（例：飢餓状態starvation飢餓状態（starvation）starvation（飢餓状態））では、ラクトースを分解できるこれらのタンパク質を産生する必要がある。したがってラクトースはグルコースの代替であり、細胞が別のエネルギー源を必要とする場合にのみ分解される。

大腸菌は酵素β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）を産生でき、これが二糖disaccharide二糖（disaccharide）disaccharide（二糖）ラクトースを2つの単糖monosaccharide単糖（monosaccharide）monosaccharide（単糖）成分——グルコースとガラクトースgalactoseガラクトース（galactose）galactose（ガラクトース）——への加水分解を触媒する。単糖monosaccharide単糖（monosaccharide）monosaccharide（単糖）はその後細菌により容易に代謝されうる。

lacオペロンの機能

常に： リプレッサー四量体tetramer四量体（tetramer）tetramer（四量体）タンパク質がオペレーターoperatorオペレーター（operator）operator（オペレーター）に結合している＝転写なし。RNAポリメラーゼの結合はcAMP活性化型CRP（CAP）二量体により増強される。Lacリプレッサーの二量体の二量体の存在が転写を妨げる。

• 条件1： ラクトースが存在しない→lacリプレッサーがlacオペレーターoperatorオペレーター（operator）operator（オペレーター）に結合し、これは転写部位と重なる＋CAPは結合していない
• 条件4： ラクトースのみが存在する→誘導物質がリプレッサータンパク質に結合する→コンフォメーション変化conformational changeコンフォメーション変化（conformational change）conformational change（コンフォメーション変化）がリプレッサーをオペロンから解離させる。cAMP-CAP複合体もまた転写開始transcription initiation転写開始（transcription initiation）transcription initiation（転写開始）頻度を大幅に増加させる→活性化により高レベルのlac mRNAの合成がもたらされる

flowchart TD
  A["グルコース(+)・ラクトース(-)"] --> B["リプレッサー結合・CAP非結合→OFF"]
  C["グルコース(-)・ラクトース(-)"] --> D["リプレッサー結合→OFF"]
  E["グルコース(+)・ラクトース(+)"] --> F["リプレッサー解離もCAP非結合→非常に低い発現・OFF"]
  G["グルコース(-)・ラクトース(+)"] --> H["リプレッサー解離＋cAMP-CAP結合→ON・高発現"]

実験

IPTG（イソプロピルisopropylイソプロピル（isopropyl）isopropyl（イソプロピル）β-D-1-チオガラクトピラノシド）はラクトース様分子であり、lacリプレッサーに対しラクトース自体と同じ効果を持つ。ラクトースに対する利点は、β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）により分解されないため、その濃度が一定に保たれる点である。

β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）はその酵素活性に基づいて検出できる。決定には合成基質ONPG（オルトorthoオルト（ortho）ortho（オルト）-ニトロフェニルnitrophenylニトロフェニル（nitrophenyl）nitrophenyl（ニトロフェニル）-β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ））——ラクトース様分子——を用いることができる。β-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）はONPGをガラクトースgalactoseガラクトース（galactose）galactose（ガラクトース）とオルトorthoオルト（ortho）ortho（オルト）-ニトロフェノールphenolフェノール（phenol）phenol（フェノール）へ加水分解する。オルトorthoオルト（ortho）ortho（オルト）-ニトロフェノールphenolフェノール（phenol）phenol（フェノール）は黄色を呈し、分光光度法により定量できる。

酵素誘導enzyme induction酵素誘導（enzyme induction）enzyme induction（酵素誘導）の過程は3段階に分けられる：

1. 誘導物質によるリプレッサーの不活性化
2. mRNA合成
3. mRNAのタンパク質への翻訳

細菌におけるβ-ガラクトシダーゼ発現への各種抗生物質の効果

誘導は上記のいずれの段階でも阻害されうる。2種類の阻害剤inhibitor阻害剤（inhibitor）inhibitor（阻害剤）を区別する：

• リファンピシン： 細菌RNAポリメラーゼの阻害剤inhibitor阻害剤（inhibitor）inhibitor（阻害剤）→転写を妨げる
• クロラムフェニコールchloramphenicolクロラムフェニコール（chloramphenicol）chloramphenicol（クロラムフェニコール）： 細菌リボソームbacterial ribosomes細菌リボソーム（bacterial ribosomes）bacterial ribosomes（細菌リボソーム）を直接阻害する→翻訳を妨げる

flowchart TD
  A["DNA"] -->|"転写（リファンピシンで阻害）"| B["mRNA"]
  B -->|"リボソームでの翻訳（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='chloramphenicol'>クロラムフェニコール</span>で阻害）"| C["ポリペプチド鎖"]
  C -->|"組み立て"| D["タンパク質（β-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='galactosidase'>ガラクトシダーゼ</span>）"]

まとめ

• lacオペロンは負の誘導性inducibility誘導性（inducibility）inducibility（誘導性）調節の代表例であり、通常はリプレッサー（LacI遺伝子産物）がオペレーターoperatorオペレーター（operator）operator（オペレーター）に結合しOFF状態にある。グルコースが存在しラクトースが存在しない場合を含む3つの条件ではオペロンはOFFのままだが、グルコース不在かつラクトース存在の条件でのみリプレッサーの解離とcAMP-CAP複合体による転写促進transcriptional activation転写促進（transcriptional activation）transcriptional activation（転写促進）が重なりONになる。
• 実験ではIPTG（分解されないラクトース様誘導物質）を用いてリプレッサーを不活性化し、合成基質ONPGのβ-ガラクトシダーゼgalactosidaseガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ）による加水分解で生じる黄色の呈色を分光光度法で測定することで酵素誘導enzyme induction酵素誘導（enzyme induction）enzyme induction（酵素誘導）を定量する。
• リファンピシン（RNAポリメラーゼ阻害→転写阻害）とクロラムフェニコールchloramphenicolクロラムフェニコール（chloramphenicol）chloramphenicol（クロラムフェニコール）（リボソーム阻害→翻訳阻害typical翻訳阻害（typical）typical（翻訳阻害））は、誘導過程のどの段階が阻害されているかを区別するために用いられる。