細胞内分画の解析

🧠 この実験の核心は「各オルガネラだけに存在する分子（マーカー）」を見つけ、それを比色反応に変換して「そこにそのオルガネラがどれだけあるか」を測る、という発想である。 核はDNA量、ミトコンドリアはコハク酸succinic acidコハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸）脱水素酵素、ミクロソーム画分Microsomal fractionミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分）はUDPグルクロニルトランスフェラーゼglucuronyltransferaseグルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase）glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ）（ER）や5’-ヌクレオチダーゼnucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase）nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）（細胞膜）、細胞質はアルギナーゼarginaseアルギナーゼ（arginase）arginase（アルギナーゼ）——分画遠心法differential centrifugation分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法）で分けた画分の「純度purity純度（purity）purity（純度）」を、その画分に特異的な酵素活性の有無で検証するのがこの実験全体の論理である。

分画研究の目的

真核細胞eukaryote真核細胞（eukaryote）eukaryote（真核細胞）は複数の細胞内区画intracellular compartment細胞内区画（intracellular compartment）intracellular compartment（細胞内区画）（核、ミトコンドリア、ER、ゴルジ、リソソーム、ペルオキシソームperoxisomeペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム）、細胞質）を含み、それぞれがその特定の区画にのみ見出される高度に特異的な高分子を含む。したがってこれらの高分子はオルガネラ特異的マーカーとみなすことができる。この実験の目的は、これらのマーカーが実際に特定の分画（区画）に特異的であることを検証することである。

マーカーには例えば、核ラミナnuclear lamina核ラミナ（nuclear lamina）nuclear lamina（核ラミナ）や細胞質のアクチン繊維actin filamentsアクチン繊維（actin filaments）actin filaments（アクチン繊維）、酵素、核酸がありうる。これらのマーカーは以下の手法を用いて同定できる：

• 免疫染色（免疫蛍光immunofluorescence, IF免疫蛍光（immunofluorescence, IF）immunofluorescence, IF（免疫蛍光））： 無傷の細胞や組織中のマーカーを検出できる。タンパク質は抗体により、DNAはDAPI（蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素））により検出される
• 免疫ブロット（ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット））： タンパク質を細胞内分画から単離し、SDS-PAGE（試料をその分子量ごとに分ける）で分離した後、ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）へ転写する
• 生化学的アッセイ： 細胞内分画由来の酵素を特異的基質存在下でインキュベートし、産物形成を分光光度計spectrophotometer分光光度計（spectrophotometer）spectrophotometer（分光光度計）/蛍光光度計でモニターする（→タンパク質の単離）

マーカーの検出は、<a href=“/topics/mcb/71-methods-in-cell-biology-cell-culturing-cell-fractionation-in-vivo-microscopy” class=“wikilink” data-goes-to=“細胞生物学の手法：細胞培養、細胞分画、in vivo顕微鏡観察、フローサイトメトリー、FACFunctional Ambulation CategoryFAC（Functional Ambulation Category）Functional Ambulation Category（FAC）S”>分画遠心法differential centrifugation分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法）と呼ばれる分画法によって単離された細胞内分画で行われる。これは細胞内オルガネラの密度の違いを利用する→粗細胞抽出液からの細胞内区画intracellular compartment細胞内区画（intracellular compartment）intracellular compartment（細胞内区画）は増加するrpm（毎分回転数）での遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）により分離される。沈降速度は各区画に特異的である：

核マーカー：ゲノムDNA

ゲノムDNAが核マーカーである。DNAの酸加水分解によりデオキシリボースriboseリボース（ribose）ribose（リボース）が得られ、これはジフェニルアミンdiphenylamineジフェニルアミン（diphenylamine）diphenylamine（ジフェニルアミン）により定量される——これが呈色縮合condensation縮合（condensation）condensation（縮合）生成物（シッフ塩基＝青色）を生じる。

flowchart TD
  A["ゲノムDNA"] --> B["酸加水分解"]
  B --> C["デオキシ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribose'>リボース</span>"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='diphenylamine'>ジフェニルアミン</span>との反応"]
  D --> E["呈色<span class='jp-term jp-term-diagram' title='condensation'>縮合</span>生成物（シッフ塩基、青色）"]

ミトコンドリアマーカー：コハク酸脱水素酵素

コハク酸succinic acidコハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸）脱水素酵素は内ミトコンドリア膜の酵素である。この酵素はその基質であるコハク酸succinic acidコハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸）から2つの水素原子を除去し、産物であるフマル酸fumarateフマル酸（fumarate）fumarate（フマル酸）を生じる。これらの水素原子は酵素に強く結合したFAD補欠分子族prosthetic group補欠分子族（prosthetic group）prosthetic group（補欠分子族）を還元できる。

酵素活性を測定するために、FADH2を再酸化できる試薬が加えられる。この反応の間、試薬の色が変化する。用いられる試薬はINT塩化物であり、そのホルマザンformazanホルマザン（formazan）formazan（ホルマザン）は赤色（低溶解性solubility溶解性（solubility）solubility（溶解性））である。

INTホルマザンformazanホルマザン（formazan）formazan（ホルマザン）を可溶化solubilization可溶化（solubilization）solubilization（可溶化）するために、「FTF混合液」で可溶化solubilization可溶化（solubilization）solubilization（可溶化）される：

• ギ酸formic acidギ酸（formic acid）formic acid（ギ酸）（pHを低下させる）
• Triton X（界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤））
• ホルムアルデヒドformaldehydeホルムアルデヒド（formaldehyde）formaldehyde（ホルムアルデヒド）（アミノ酸残基amino acid residueアミノ酸残基（amino acid residue）amino acid residue（アミノ酸残基）と反応する）

→ FTF混合液を加えることで、赤色溶液を見ることができる（INTホルマザンformazanホルマザン（formazan）formazan（ホルマザン）が可溶化solubilization可溶化（solubilization）solubilization（可溶化）されるため）。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinic acid'>コハク酸</span>"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinic acid'>コハク酸</span>脱水素酵素"| B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='fumarate'>フマル酸</span>+2H"]
  B --> C["FADが還元されFADH2に"]
  C --> D["INT塩化物によるFADH2の再酸化"]
  D --> E["INT<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formazan'>ホルマザン</span>（赤色、低<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubility'>溶解性</span>）形成"]
  E --> F["FTF混合液（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formic acid'>ギ酸</span>+Triton X+<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formaldehyde'>ホルムアルデヒド</span>）による<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubilization'>可溶化</span>"]
  F --> G["赤色溶液として測定可能"]

ミクロソーム画分

ミクロソーム画分Microsomal fractionミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分）は、ERやゴルジ膜のような大きな細胞内膜系の細胞抽出人工産物artifact人工産物（artifact）artifact（人工産物）である小胞を大部分含む。ペルオキシソームperoxisomeペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム）や細胞膜断片も含みうる。

ERマーカー：UDPグルクロニルトランスフェラーゼ

マーカーはUDPグルクロニルトランスフェラーゼglucuronyltransferaseグルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase）glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ）である。人工的な黄色の基質（p-ニトロフェノールphenolフェノール（phenol）phenol（フェノール））が、UDP-グルクロン酸glucuronic acidグルクロン酸（glucuronic acid）glucuronic acid（グルクロン酸）のグルクロン酸glucuronic acidグルクロン酸（glucuronic acid）glucuronic acid（グルクロン酸）部分を疎水性分子hydrophobic molecule疎水性分子（hydrophobic molecule）hydrophobic molecule（疎水性分子）へ転移する反応を触媒するウリジン二リン酸-グルクロノシルトランスフェラーゼglucuronosyltransferaseグルクロノシルトランスフェラーゼ（glucuronosyltransferase）glucuronosyltransferase（グルクロノシルトランスフェラーゼ）とともに用いられる→体外への排出が容易なより親水性hydrophilic親水性（hydrophilic）hydrophilic（親水性）の化合物を産生する。

→ 反応の産物はビリルビンのモノ/ジグルクロニドMorphine-6-glucuronideグルクロニド（Morphine-6-glucuronide）Morphine-6-glucuronide（グルクロニド）であり、水溶性で無毒である。

細胞膜マーカー：5’-ヌクレオチダーゼ

マーカーは5’ヌクレオチダーゼnucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase）nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）である。Fiske-Subbarow比色リン酸アッセイにより5’ヌクレオチダーゼnucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase）nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）レベルを決定する。5’ヌクレオチダーゼnucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase）nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）は、Mg²⁺イオン存在下でグリシン-NaOH緩衝液（pH8.5）中のAMPを用いて細胞内分画からアッセイされる。

細胞質マーカー：アルギナーゼ

マーカーはアルギナーゼarginaseアルギナーゼ（arginase）arginase（アルギナーゼ）である。哺乳類mammal哺乳類（mammal）mammal（哺乳類）の肝臓において、アルギナーゼarginaseアルギナーゼ（arginase）arginase（アルギナーゼ）は細胞質に局在し、尿素回路urea cycle尿素回路（urea cycle）urea cycle（尿素回路）の最終酵素反応を触媒する。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='arginine (Arg)'>アルギニン</span>+H2O"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='arginase'>アルギナーゼ</span>"| B["オルニチン+尿素"]
  B --> C["ジアセチルモノオキシム+チオセミカルバジドとの反応"]
  C --> D["呈色生成物"]

まとめ

• 各細胞内区画intracellular compartment細胞内区画（intracellular compartment）intracellular compartment（細胞内区画）は特異的なマーカー分子（核：ゲノムDNA、ミトコンドリア：コハク酸succinic acidコハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸）脱水素酵素、ER：UDPグルクロニルトランスフェラーゼglucuronyltransferaseグルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase）glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ）、細胞膜：5’-ヌクレオチダーゼnucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase）nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）、細胞質：アルギナーゼarginaseアルギナーゼ（arginase）arginase（アルギナーゼ））を持ち、これらは免疫染色・ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）・生化学的アッセイにより同定される。
• 分画遠心法differential centrifugation分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法）は細胞内オルガネラの密度の違いを利用し、増加するg値（1000→11,000→100,000→>100,000）で粗細胞抽出液を遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）することで各分画を分離する。
• 各マーカー酵素はそれぞれ特異的な比色反応（DNA→デオキシリボースriboseリボース（ribose）ribose（リボース）→ジフェニルアミンdiphenylamineジフェニルアミン（diphenylamine）diphenylamine（ジフェニルアミン）発色、コハク酸succinic acidコハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸）→フマル酸fumarateフマル酸（fumarate）fumarate（フマル酸）→INTホルマザンformazanホルマザン（formazan）formazan（ホルマザン）発色など）に基づいて定量され、分画の純度purity純度（purity）purity（純度）を検証するために用いられる。