Medical Microbiology · 5/33

微生物学で用いられる分子生物学的検査法

Molecular examination methods used in microbiology

検査値: 核酸増幅検査

🧠 分子生物学的検査molecular methods分子生物学的検査（molecular methods）molecular methods（分子生物学的検査）法の強みは「病原体そのものではなく遺伝情報を検出する」ことに尽きる。抗原検出や培養に頼らない分、感度・特異度が高く、培養困難な病原体や数週間かかる培養でも数時間〜数日で結果が出る。ただし1/8・1/9で学んだ「細菌がどう変異し、遺伝子をどう伝達するか」という生物学的機序とは主題が異なる——本トピックの主役は、その遺伝子を検査室でどう検出するかという技術である。

分子生物学的検査の利点

高い感度・特異度
抗原ではなく病原体そのもの（の遺伝情報）を検出する
高い輸送耐性——微量の検体でも検査可能
培養より迅速に結果が得られる

いつ分子生物学的検査を使うか

血清学的検査に適さない検体（便、水疱液など）
頻度の高い感染症（インフルエンザ、腸管ウイルス感染症）
交差反応cross-reactivity交差反応（cross-reactivity）cross-reactivity（交差反応）を避けたい場合
ウイルス株の同定、ウイルス変異、抗原シフトantigenic shift抗原シフト（antigenic shift）antigenic shift（抗原シフト）／ドリフトのエピジェネティックepigeneticエピジェネティック（epigenetic）epigenetic（エピジェネティック）検査
治療モニタリング——ウイルスコピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）の測定（HIV・HCV・HBV）
薬剤耐性検査drug susceptibility testing薬剤耐性検査（drug susceptibility testing）drug susceptibility testing（薬剤耐性検査）（HIV・HCV）
検体保存：4°Cで24時間、または−20°Cで24時間超（至適は−70°C）

PCR：DNAの増幅

菌種の同定に利用できる。
Chlamydiaのように培養が困難な細菌の診断に利用できる。
耐性遺伝子の検出に利用できる。
毒素そのものではなく、毒素産生遺伝子の検出に利用できる。
プライマーはウイルスゲノムの保存領域conserved region保存領域（conserved region）conserved region（保存領域）に設計され、全ての遺伝子型を検出できるようにする。
DNAウイルス：ネステッドPCRnested PCRネステッドPCR（nested PCR）nested PCR（ネステッドPCR）（nested PCR）——プライマーの非特異的結合aspecific binding非特異的結合（aspecific binding）aspecific binding（非特異的結合）を減らす目的で用いる。
RNAウイルス：逆転写PCR（reverse transcription PCR, RT-PCR）——RNAを鋳型にcDNAを合成してから増幅する。

flowchart TD
    A["鋳型となる2本鎖DNA"] --> B["① 変性94〜96°C<br>2本鎖DNAが1本鎖に解離する"]
    B --> C["② <span class='jp-term jp-term-diagram' title='annealing'>アニーリング</span>約68°C<br>プライマーが1本鎖DNAに結合する"]
    C --> D["③ 伸長約72°C<br>DNAポリメラーゼがプライマーから新生鎖を合成する"]
    D --> E["2本鎖DNAが2倍に増幅される"]
    E -->|"サイクルを繰り返す"| B

定量PCR

リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）（real-time PCR, QPCR）とも呼ばれる。
治療モニタリングに用いる。
施設ごとにキャリブレーションが異なるため、異なる検査室間の結果は比較できない。
反応終了時点ではなく、反応の途中で標的DNAの増幅量を検出する点が通常のPCRとの違い。
検出は蛍光を利用する：
- 二本鎖DNAに非特異的に結合する蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）
- 相補配列とハイブリダイズした後にのみ検出可能となる、蛍光レポーターで標識された配列特異的DNAプローブ

サザンブロット・ノーザンブロット

サザンブロットSouthern blotサザンブロット（Southern blot）Southern blot（サザンブロット）：DNA断片の検出。
ノーザンブロットNorthern blotノーザンブロット（Northern blot）Northern blot（ノーザンブロット）：RNA断片の検出。

抗体検出：ELISA

酵素反応が基質を発色産物に変え、その色調変化から抗体量を算出する。

酵素標識enzyme label酵素標識（enzyme label）enzyme label（酵素標識）抗ヒト抗体を用いて対象抗体を検出する。
酵素-基質反応により発色させる。
洗浄ステップが結果の信頼性reliability信頼性（reliability）reliability（信頼性）を左右する重要な工程。
発色が濃いほど、対象抗体の量が多いことを示す。

まとめ

分子生物学的検査molecular methods分子生物学的検査（molecular methods）molecular methods（分子生物学的検査）は病原体の遺伝情報を直接検出するため、感度・特異度が高く、培養困難な病原体や微量検体にも対応できる。
PCRはDNAを指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）に増幅する手法で、変性→アニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）→伸長のサイクルを繰り返す。DNAウイルスにはネステッドPCRnested PCRネステッドPCR（nested PCR）nested PCR（ネステッドPCR）、RNAウイルスには逆転写PCR（RT-PCR）を用いる。
定量PCRquantitative PCR定量PCR（quantitative PCR）quantitative PCR（定量PCR）（qPCR）は反応の途中で増幅量を蛍光検出fluorescence detection蛍光検出（fluorescence detection）fluorescence detection（蛍光検出）し、治療モニタリングに用いるが、施設間の結果比較はできない。
サザンブロットSouthern blotサザンブロット（Southern blot）Southern blot（サザンブロット）はDNA、ノーザンブロットNorthern blotノーザンブロット（Northern blot）Northern blot（ノーザンブロット）はRNAの検出に用いる。
ELISAは酵素-基質反応による発色を利用した抗体検出antibody detection抗体検出（antibody detection）antibody detection（抗体検出）法で、洗浄ステップの精度が結果の信頼性reliability信頼性（reliability）reliability（信頼性）を左右する。
本トピックが扱う「検査室での遺伝子検出技術Detection technology検出技術（Detection technology）Detection technology（検出技術）」は、1/8・1/9で学んだ「細菌における遺伝子の変異・伝達の生物学的機序」とは別の主題である点に注意。