半保存的DNA複製の原理；複製フォーク、リーディング鎖とラギング鎖の合成

🧠 DNADNA（deoxyribonucleic acid）複製の全ての複雑さは「2本鎖が逆平行 anti-parallel 逆平行（anti-parallel） anti-parallel（逆平行） である」という1つの幾何学的制約 Limitations 制約（Limitations） Limitations（制約） から生まれる。 DNAポリメラーゼは5′→3′方向にしか鎖を伸ばせないため、複製フォークreplication fork 複製フォーク（replication fork）replication fork（複製フォーク） の進行方向と同じ向きの鎖（リーディング鎖leading strandリーディング鎖（leading strand）leading strand（リーディング鎖）、leading strand）は連続的に、逆向きの鎖（ラギング鎖lagging strandラギング鎖（lagging strand）lagging strand（ラギング鎖）、lagging strand）はDNAポリメラーゼが後ろ向きに小分けで合成する「岡崎フラグメントOkazaki fragment岡崎フラグメント（Okazaki fragment）Okazaki fragment（岡崎フラグメント）」方式にならざるを得ない——半保存的複製 semiconservative replication 半保存的複製（semiconservative replication） semiconservative replication（半保存的複製） という原理はシンプルだが、その実装は非対称にならざるを得ないということ。

背景

DNAは2本の鎖が二重らせん double helix 二重らせん（double helix） double helix（二重らせん） 状に互いに巻き付いた分子である。各鎖は塩基配列（A-T、C-G）からなり、2本の鎖は相補的——一方の鎖にTがあれば対岸には必ずAがある。各鎖には5′末端と3′末端があり、2本の鎖は逆方向に走る（逆平行anti-parallel逆平行（anti-parallel）anti-parallel（逆平行）、antiparallel）——この逆平行 anti-parallel 逆平行（anti-parallel） anti-parallel（逆平行） 性こそが、各鎖の複製様式を決定する。

半保存的複製semiconservative replication半保存的複製（semiconservative replication）semiconservative replication（半保存的複製）：既知の全ての細胞でDNAが複製される機構。2つのコピーが生成され、それぞれが元の鎖（親、parent）1本と新しい鎖（娘、daughter）1本を含む。

複製の機序

1. 複製フォークの形成

DNA二重らせん double helix 二重らせん（double helix） double helix（二重らせん） の両鎖が複製時の鋳型として機能するには、まず巻き戻される必要がある。この親DNA鎖の巻き戻しはヘリカーゼhelicaseヘリカーゼ（helicase）helicase（ヘリカーゼ）（水素結合を切断する酵素）により行われ、複製フォークreplication fork複製フォーク（replication fork）replication fork（複製フォーク）の形成をもたらす。原核生物では、巻き戻しはDNA分子上のoriC（複製起点replication origin複製起点（replication origin）replication origin（複製起点）、origin of replication）というセグメントで始まる。

二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） DNAの局所的な巻き戻しはトーショナルストレス torsional stress トーショナルストレス（torsional stress） torsional stress（トーショナルストレス） を生み、これはトポイソメラーゼItopoisomerase IトポイソメラーゼI（topoisomerase I）topoisomerase I（トポイソメラーゼI）（1本鎖を切断し他方の周りで巻き戻す、右巻き正の超らせん化を解消）により解消される（02-condensation-of-the-genetic-material-in-pro-and-eukaryotic-cells-the-role-of参照）。DNAポリメラーゼが二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） DNAに沿って移動しコピーするには、ヘリカーゼhelicase ヘリカーゼ（helicase）helicase（ヘリカーゼ） が順次巻き戻し、トポイソメラーゼtopoisomerase トポイソメラーゼ（topoisomerase）topoisomerase（トポイソメラーゼ） がスーパーコイル supercoil スーパーコイル（supercoil） supercoil（スーパーコイル） を除去する必要がある。親DNA二重らせん double helix 二重らせん（double helix） double helix（二重らせん） の2本鎖は逆平行 anti-parallel 逆平行（anti-parallel） anti-parallel（逆平行） であるため、それぞれ異なる様式で複製される。

複製フォークreplication fork複製フォーク（replication fork）replication fork（複製フォーク）は娘鎖の合成を実行するために全てのタンパク質が集まるDNA領域であり、以下の順序で形成される4つの構成要素からなる：

1. DNAヘリカーゼ helicaseヘリカーゼ（helicase） helicase（ヘリカーゼ）が親二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） DNAの短いセグメントを巻き戻す
2. プライマーゼprimaseプライマーゼ（primase）primase（プライマーゼ）がDNA合成に不可欠なRNARNA（ribonucleic acid）分子（プライマー、primer）の合成を開始する
3. DNAポリメラーゼIIIが娘鎖合成を開始する
4. SSB（一本鎖DNAsingle-stranded DNA 一本鎖DNA（single-stranded DNA）single-stranded DNA（一本鎖DNA） 結合タンパク質、single-strand DNA-binding protein）がssDNAに結合し、ssDNAがdsDNAへ早期に再アニールするのを防ぐ

複製が進むにつれ、複製フォークreplication fork 複製フォーク（replication fork）replication fork（複製フォーク） とタンパク質群は起点から離れていく。

💡 この節は原核生物と真核生物の酵素名が混在している点に注意。 上で複製フォーク replication fork 複製フォーク（replication fork） replication fork（複製フォーク） の構成要素として挙げたDNAポリメラーゼIIIは細菌の主複製酵素 replicase 複製酵素（replicase） replicase（複製酵素） であり、後述の岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） 処理に出てくるDNAポリメラーゼδは真核生物のラギング鎖 lagging strand ラギング鎖（lagging strand） lagging strand（ラギング鎖） 側の酵素である。真核生物のリーディング鎖 leading strand リーディング鎖（leading strand） leading strand（リーディング鎖） 側は主にDNAポリメラーゼεが担うことが、複製の忠実度を下げた変異型 mutant 変異型（mutant） mutant（変異型） ポリメラーゼεを用いた解析（変異の向きが複製起点 replication origin 複製起点（replication origin） replication origin（複製起点） との位置関係に依存する）から示されている¹。原核・真核の対応関係そのものは次のトピック（原核・真核の複製の比較）で扱う。

💡 真核生物の複製起点 replication origin 複製起点（replication origin） replication origin（複製起点） は、oriCのような決まった1点ではない。 細菌の環状染色体 ring chromosome 環状染色体（ring chromosome） ring chromosome（環状染色体） は単一のoriCから両方向へ複製が進むが、ヒトでは高純度 purity 純度（purity） purity（純度） に精製 purification 精製（purification） purification（精製） した岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） をシーケンスしてフォークの進行方向をゲノム全域で定量した解析により、複製は主として非転写領域にある最大150 kbにおよぶ幅の広い「開始ゾーン」の内部で確率的 stochastic (vs. deterministic) 確率的（stochastic (vs. deterministic)） stochastic (vs. deterministic)（確率的） に開始し、その間の領域で分散的に終結することが示された。フォークの進行方向は転写の向きと有意に共方向である²。「ヒトの複製起点 replication origin 複製起点（replication origin） replication origin（複製起点） は何個か」に一意の答えが出にくいのはこのためで、どこで開始するかは細胞・分裂ごとに揺らぐ。

2. プライマー合成

ヘリカーゼhelicase ヘリカーゼ（helicase）helicase（ヘリカーゼ） が親DNAを巻き戻すと、プライマーゼprimase プライマーゼ（primase）primase（プライマーゼ） が巻き戻された鋳型鎖に相補的な短い（約12ヌクレオチド）RNAプライマーを形成する。これが新しいDNA鎖構築の開始点となる。

3. 鎖の伸長

DNAポリメラーゼがプライマーに結合し、さらに約25ヌクレオチド伸長する——結果として5′端がRNA、3′端がDNAからなるプライマーが形成される。

4. リーディング鎖とラギング鎖

親DNA二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） の2本鎖は逆平行 anti-parallel 逆平行（anti-parallel） anti-parallel（逆平行） であり、DNAポリメラーゼは娘鎖に5′→3′方向にのみヌクレオチドを付加できる。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='replication fork'>複製フォーク</span>：親<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>二<span class='jp-term jp-term-diagram' title='heavy chain'>重鎖</span>の巻き戻し"] --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='leading strand'>リーディング鎖</span>：単一<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>プライマーから5'→3'方向へ連続合成"]
  A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='lagging strand'>ラギング鎖</span>：フォーク進行方向と逆向き"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Okazaki fragment'>岡崎フラグメント</span>ごとに<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>プライマーを新規合成"]
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>ポリメラーゼが5'→3'方向へ短い<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>鎖を付加"]
  E --> F["次のプライマーがさらに下流に追加され、次の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Okazaki fragment'>岡崎フラグメント</span>を合成"]
  F --> D
  D --> G["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='exonuclease'>エキソヌクレアーゼ</span>が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>プライマーを除去"]
  G --> H["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>ポリメラーゼδがギャップを<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>で埋める"]
  H --> I["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span><span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligase'>リガーゼ</span>が隣接フラグメントを連結→連続した二本鎖"]

岡崎フラグメントOkazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment）Okazaki fragment（岡崎フラグメント） の合成過程：

1. 各フラグメントはRNAプライマーから開始される
2. DNAポリメラーゼが5′→3′方向に短いDNA塩基の列を付加する。次のプライマーはラギング鎖 lagging strand ラギング鎖（lagging strand） lagging strand（ラギング鎖） のさらに下流に追加される
3. 別の岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） が作られ、この過程が繰り返される
4. 新しいDNAが合成されると、エキソヌクレアーゼexonucleaseエキソヌクレアーゼ（exonuclease）exonuclease（エキソヌクレアーゼ）が両鎖から全てのRNAプライマーを除去する。別のDNAポリメラーゼ（δ）がその後にできたギャップをDNAで埋める
5. 最後にDNAリガーゼ ligaseリガーゼ（ligase） ligase（リガーゼ）が隣接するDNA断片を連結し、連続した二本鎖を形成する

⭐ リボヌクレアーゼH（ribonuclease H, RNase H）は岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） の5′端のリボヌクレオチド ribonucleotide リボヌクレオチド（ribonucleotide） ribonucleotide（リボヌクレオチド） を除去し、デオキシリボヌクレオチドdeoxyribonucleotide デオキシリボヌクレオチド（deoxyribonucleotide）deoxyribonucleotide（デオキシリボヌクレオチド） に置き換える（RNA→DNAへの上書き）。

💡 真核生物では岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） の長さをヌクレオソーム nucleosome ヌクレオソーム（nucleosome） nucleosome（ヌクレオソーム） が決めている。 ゲノムの50%はラギング鎖 lagging strand ラギング鎖（lagging strand） lagging strand（ラギング鎖） として岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） の形で不連続に複製される。出芽酵母budding yeasts 出芽酵母（budding yeasts）budding yeasts（出芽酵母） でライゲーション ligation ライゲーション（ligation） ligation（ライゲーション） 可能な岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） を深部シーケンスした研究では、フラグメントの大きさがヌクレオソーム nucleosome ヌクレオソーム（nucleosome） nucleosome（ヌクレオソーム） 反復長に一致し、連結部ligation junction 連結部（ligation junction）ligation junction（連結部） はヌクレオソーム nucleosome ヌクレオソーム（nucleosome） nucleosome（ヌクレオソーム） 間のリンカー linker リンカー（linker） linker（リンカー） 領域ではなくヌクレオソーム nucleosome ヌクレオソーム（nucleosome） nucleosome（ヌクレオソーム） の中央付近に偏ることが示された。クロマチン形成を妨げたり、ラギング鎖lagging strand ラギング鎖（lagging strand）lagging strand（ラギング鎖） ポリメラーゼの進行性を変えたりすると、フラグメントの大きさと分布がともに変化する³。つまり複製フォークreplication fork 複製フォーク（replication fork）replication fork（複製フォーク） 通過直後に組み立てられる新生クロマチンが、岡崎フラグメントOkazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment）Okazaki fragment（岡崎フラグメント） 合成の終了点を決めている——「岡崎フラグメントOkazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment）Okazaki fragment（岡崎フラグメント） 長」は酵素だけで決まる固有値ではない。

まとめ

• DNA複製は半保存的（各娘二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） が親鎖1本＋新生鎖1本を含む）であり、ヘリカーゼhelicase ヘリカーゼ（helicase）helicase（ヘリカーゼ） による巻き戻し・トポイソメラーゼItopoisomerase I トポイソメラーゼI（topoisomerase I）topoisomerase I（トポイソメラーゼI） によるトーショナルストレス torsional stress トーショナルストレス（torsional stress） torsional stress（トーショナルストレス） 解消・プライマーゼprimase プライマーゼ（primase）primase（プライマーゼ） によるRNAプライマー合成 primer synthesisプライマー合成（primer synthesis） primer synthesis（プライマー合成）・DNAポリメラーゼIIIによる娘鎖合成・SSBによるssDNA保護という4要素が複製フォーク replication fork 複製フォーク（replication fork） replication fork（複製フォーク） を構成する。
• DNAポリメラーゼは5′→3′方向にしか合成できないため、フォーク進行方向と同じ向きのリーディング鎖 leading strand リーディング鎖（leading strand） leading strand（リーディング鎖） は連続合成、逆向きのラギング鎖 lagging strand ラギング鎖（lagging strand） lagging strand（ラギング鎖） は岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） という不連続な断片として合成される。
• 岡崎フラグメントOkazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment）Okazaki fragment（岡崎フラグメント） はRNAプライマーから開始し、エキソヌクレアーゼexonuclease エキソヌクレアーゼ（exonuclease）exonuclease（エキソヌクレアーゼ） （RNase H含む）によるプライマー除去、DNAポリメラーゼδによるギャップ充填、DNAリガーゼ ligase リガーゼ（ligase） ligase（リガーゼ） による連結という3段階の後処理を経て連続鎖となる。
• 真核生物では岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） の大きさがヌクレオソーム nucleosome ヌクレオソーム（nucleosome） nucleosome（ヌクレオソーム） 反復長に一致し、新生クロマチンの組み立てが断片の終了点を決めている（ゲノムの50%がこの不連続様式で複製される）。
• 複製起点replication origin 複製起点（replication origin）replication origin（複製起点） も原核・真核で性格が異なる——細菌は単一のoriC、ヒトは最大150 kbの幅を持つ「開始ゾーン」内での確率的 stochastic (vs. deterministic) 確率的（stochastic (vs. deterministic)） stochastic (vs. deterministic)（確率的） な開始であり、フォークの向きは転写の向きと共方向になりやすい。