P/O比の実験的決定

🧠 実習は「単離ミトコンドリアの酸素消費を追い、ATP合成量との対応からP/O比を求める」と読む。 酸素電極でADP添加後の呼吸加速を確認し、ADPパルス法、リン酸取り込み法、またはATP産生と酸素消費の同時測定でP/O比を算出する。¹ 阻害薬・脱共役剤uncoupler脱共役剤（uncoupler）uncoupler（脱共役剤）で共役の仕組みを実証する。

原理：化学浸透説

化学浸透説chemiosmotic theory 化学浸透説（chemiosmotic theory）chemiosmotic theory（化学浸透説） によれば、呼吸基質の酸化・ADPのリン酸化・イオン輸送は、すべてプロトン駆動力proton motive force プロトン駆動力（proton motive force）proton motive force（プロトン駆動力） （ΔpHと膜電位Δψₘ）を共通の中間体として共役している。ATP合成には数個のH⁺の再流入が必要で、ATP/ADP交換とリン酸取り込みまで含めた細胞質ATP供給の実効コストはさらに大きくなる。

呼吸調節とP/O比

無傷のミトコンドリアが呼吸基質を酸化しADPをリン酸化するとき、酸素消費速度とATP合成量の両方を測れる。

• 呼吸調節acceptor / respiratory control呼吸調節（acceptor / respiratory control）acceptor / respiratory control（呼吸調節）: 至適条件ではADP添加で呼吸が加速する。ただし呼吸速度はADPだけでなくPi、還元状態、酸素化などにも影響される。
• 呼吸調節比respiratory control ratio (RCR)呼吸調節比（respiratory control ratio (RCR)）respiratory control ratio (RCR)（呼吸調節比） ＝ v(+ADP) ÷ v(−ADP)（State 3 ÷ State 4）。 呼吸とATP合成の共役の良さを表す。
• P/O比（ADP/O、ATP/O）は、ADPパルス法、リン酸取り込み法、またはATP合成速度と酸素消費速度の同時測定から算出する。基質が電子伝達系 electron transport chain 電子伝達系（electron transport chain） electron transport chain（電子伝達系） に入る位置で値が異なる。

flowchart TD
  A["ミトコンドリア＋基質、ADPなし<br>H⁺の漏れの分だけ<br>ゆっくり酸素を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='State 2'>消費</span>"]
  A --> B["既知量のADPを添加<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='State 3'>呼吸加速</span>"]
  B --> C["ADPがすべてATPになる<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='State 4'>呼吸減速</span>"]
  C --> D["State 3 の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oxygen consumption'>酸素消費量</span>と<br>加えたADP量から ADP/O比"]
  C --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='respiratory control ratio (RCR)'>呼吸調節比</span><br>＝ State 3 ÷ State 4 の速度"]

計算のしかた（ADPパルス法）: ADP/O比 ＝ 加えたADP（nmol）÷ State 3 の間に消費した酸素原子（nmol O）。酸素電極は溶存O₂の濃度を測るので、O₂ 1分子＝O原子2個として換算する（O₂の量で割ると値が2倍に出る誤りに注意）。

基質の入り口と阻害薬の作用点（反応図）

実習で使う2種類の基質は、電子伝達系electron transport chain 電子伝達系（electron transport chain）electron transport chain（電子伝達系） への入り口が違う。これが阻害薬への反応の違いを生む。下の図の後半（NADH・コハク酸succinic acid コハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸） からH₂Oまで）は、運び手から運び手へ電子が渡る流れを描いたもので、各矢印の運び手自身の酸化還元 oxidoreduction (redox) 酸化還元（oxidoreduction (redox)） oxidoreduction (redox)（酸化還元） はラベルに書いた。

flowchart TD
  subgraph NADSUB["グルタミン酸＋<span class='jp-term jp-term-diagram' title='malate'>リンゴ酸</span>（NADH連結基質）"]
    MAL["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='malate'>リンゴ酸</span>"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='malate dehydrogenase (MDH)'>リンゴ酸脱水素酵素</span><br>NAD⁺ → NADH"| OAA["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oxaloacetate'>オキサロ酢酸</span>"]
    OAA -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='aspartate aminotransferase (AST)'>アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ</span><br>グルタミン酸 → <span class='jp-term jp-term-diagram' title='alpha-ketoglutarate'>α-ケトグルタル酸</span><br>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oxaloacetate'>オキサロ酢酸</span>を除いて反応を進める）"| ASP["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='aspartate'>アスパラギン酸</span>"]
    NADH["NADH"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complex I'>複合体I</span><br>NADH → NAD⁺<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='ubiquinone (coenzyme Q)'>ユビキノン</span> → ユビキノール<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='rotenone'>ロテノン</span>で阻害"| QH2["ユビキノール"]
  end
  subgraph SUCSUB["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinic acid'>コハク酸</span>（FADH₂連結基質）"]
    SUC["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinic acid'>コハク酸</span>"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complex I'>複合体I</span>I（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinate dehydrogenase (SDH)'>コハク酸デヒドロゲナーゼ</span>）<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='flavin adenine dinucleotide'>FAD</span> → FADH₂<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='malonate'>マロン酸</span>が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competitive inhibition'>競合阻害</span>"| FUM["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='fumarate'>フマル酸</span>"]
    SUC -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complex I'>複合体I</span>I<br>電子を FADH₂ 経由で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ubiquinone (coenzyme Q)'>ユビキノン</span>へ<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='ubiquinone (coenzyme Q)'>ユビキノン</span> → ユビキノール"| QH2
  end
  QH2 -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complex III'>複合体III</span><br>ユビキノール → <span class='jp-term jp-term-diagram' title='ubiquinone (coenzyme Q)'>ユビキノン</span><br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='antimycin A'>アンチマイシンA</span>で阻害"| CYTC["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='reduced form'>還元型</span><span class='jp-term jp-term-diagram' title='cytochrome'>シトクロム</span>c"]
  CYTC -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complex IV'>複合体IV</span><br>O₂ ＋ 4H⁺ ＋ 4e⁻ → 2H₂O<br>シアン化カリウムで阻害"| H2O["H₂O（ここで酸素が消費され、電極が検出する）"]

阻害薬・脱共役剤の効果

各薬剤の効果を酸素電極で観察し、共役の仕組みを実証する。

⚠️ 薬剤への反応は作用点 target 作用点（target） target（作用点） と使用基質を組み合わせて解釈する。 シアン化カリウムのような末端（複合体IVcomplex IV複合体IV（complex IV）complex IV（複合体IV））の遮断では脱共役剤 uncoupler 脱共役剤（uncoupler） uncoupler（脱共役剤） を加えても呼吸は戻らない。一方、マロン酸malonate マロン酸（malonate）malonate（マロン酸） は複合体I complex I 複合体I（complex I） complex I（複合体I） Iを競合阻害 competitive inhibition 競合阻害（competitive inhibition） competitive inhibition（競合阻害） するため、複合体Icomplex I 複合体I（complex I）complex I（複合体I） へ電子を入れる基質系では迂回できる。単に「再開するか」だけでなく、どの電子流入経路を使っているかを確認する。

クラーク型酸素電極

溶存酸素を電気化学的に測る装置。

• 構成: 参照電極（銀/塩化銀silver chloride塩化銀（silver chloride）silver chloride（塩化銀））と白金電極（負極）を飽和KCl中に置き、ポリエチレン膜で反応液と隔てる。
• 原理: 一定の分極電圧（0.6 V）をかけると、膜を通った酸素が白金電極で電解還元され、電流が酸素濃度に比例する（拡散律速diffusion-limited 拡散律速（diffusion-limited）diffusion-limited（拡散律速） 電流のプラトー plateau プラトー（plateau） plateau（プラトー） 領域を利用）。
• 反応槽は恒温・撹拌し、気泡air bubble 気泡（air bubble）air bubble（気泡） を入れない。ジチオナイトdithionite ジチオナイト（dithionite）dithionite（ジチオナイト） 添加で酸素ゼロ点を校正 proofreading 校正（proofreading） proofreading（校正） する。

実験の流れ

1. 反応液KCl/Tris/EGTA/KH₂PO₄, pH 7.2 反応液（KCl/Tris/EGTA/KH₂PO₄, pH 7.2）KCl/Tris/EGTA/KH₂PO₄, pH 7.2（反応液） に基質（グルタミン酸＋リンゴ酸 malateリンゴ酸（malate） malate（リンゴ酸）、またはコハク酸 succinic acidコハク酸（succinic acid） succinic acid（コハク酸））を加える。
2. ラットrat ラット（rat）rat（ラット） 肝から単離したミトコンドリアを添加、呼吸速度（傾き）を記録。
3. 既知量のADPを添加し、加速した酸素消費を記録 → 消費O₂とADP量からADP/O比を算出する。ATP合成量を直接測る場合はATP/O（実効P/O）として表す。目安は、グルタミン酸＋リンゴ酸 malate リンゴ酸（malate） malate（リンゴ酸） （NADH連結基質）で約2.5、コハク酸succinic acid コハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸） で約1.5（理論値との関係はP/O比）。傷んだミトコンドリアではH⁺が漏れて低く出る。
4. オリゴマイシンoligomycinオリゴマイシン（oligomycin）oligomycin（オリゴマイシン）・2,4-ジニトロフェノール dinitrophenol (DNP)ジニトロフェノール（dinitrophenol (DNP)） dinitrophenol (DNP)（ジニトロフェノール）・シアン化カリウム・カルボキシアトラクチロシドcarboxyatractylosideカルボキシアトラクチロシド（carboxyatractyloside）carboxyatractyloside（カルボキシアトラクチロシド）・マロン酸malonate マロン酸（malonate）malonate（マロン酸） を順に加え、効果を観察。

まとめ

• 化学浸透説chemiosmotic theory 化学浸透説（chemiosmotic theory）chemiosmotic theory（化学浸透説） ：酸化・リン酸化・イオン輸送はプロトン駆動力 proton motive force プロトン駆動力（proton motive force） proton motive force（プロトン駆動力） を共通中間体として共役。
• 単離ミトコンドリアの酸素消費をクラーク型酸素電極 Clark-type oxygen electrode クラーク型酸素電極（Clark-type oxygen electrode） Clark-type oxygen electrode（クラーク型酸素電極） で追う。ADPが呼吸を加速（呼吸調節acceptor / respiratory control呼吸調節（acceptor / respiratory control）acceptor / respiratory control（呼吸調節））。
• 呼吸調節比respiratory control ratio (RCR) 呼吸調節比（respiratory control ratio (RCR)）respiratory control ratio (RCR)（呼吸調節比） ＝v(+ADP)/v(−ADP)は共役の強さ、P/O比は酸素消費あたりのATP産生効率を表し、両者は同じ指標ではない。²
• 2,4-ジニトロフェノール dinitrophenol (DNP) ジニトロフェノール（dinitrophenol (DNP)） dinitrophenol (DNP)（ジニトロフェノール） （脱共役uncoupling脱共役（uncoupling）uncoupling（脱共役））・オリゴマイシンoligomycin オリゴマイシン（oligomycin）oligomycin（オリゴマイシン） （ATP合成酵素ATP synthaseATP合成酵素（ATP synthase）ATP synthase（ATP合成酵素））・アトラクチロシドatractyloside (ANT inhibitor) アトラクチロシド（atractyloside (ANT inhibitor)）atractyloside (ANT inhibitor)（アトラクチロシド） （ADP/ATP輸送体）・シアン化カリウム/マロン酸malonate マロン酸（malonate）malonate（マロン酸） （呼吸鎖respiratory chain呼吸鎖（respiratory chain）respiratory chain（呼吸鎖））で共役を実証。
• オリゴマイシンoligomycinオリゴマイシン（oligomycin）oligomycin（オリゴマイシン）・アトラクチロシドatractyloside (ANT inhibitor) アトラクチロシド（atractyloside (ANT inhibitor)）atractyloside (ANT inhibitor)（アトラクチロシド） で止まった呼吸は脱共役剤 uncoupler 脱共役剤（uncoupler） uncoupler（脱共役剤） で戻るが、呼吸鎖respiratory chain 呼吸鎖（respiratory chain）respiratory chain（呼吸鎖） 阻害で止まった呼吸はADP・脱共役剤uncoupler 脱共役剤（uncoupler）uncoupler（脱共役剤） を加えても戻らない。ただしマロン酸 malonate マロン酸（malonate） malonate（マロン酸） （複合体Icomplex I 複合体I（complex I）complex I（複合体I） I）の阻害は、グルタミン酸＋リンゴ酸 malate リンゴ酸（malate） malate（リンゴ酸） のように複合体I complex I 複合体I（complex I） complex I（複合体I） から電子を入れる基質なら迂回できる。