Biochemistry · 1/6
タンパク質の診断・構造解析法とその医学的応用；LDHサブユニットのゲル電気泳動
Protein diagnostic and structure-testing methods and their medical applications; gel electrophoresis of LDH subunits — P I
🧠 タンパク質分析protein analysisタンパク質分析（protein analysis）protein analysis（タンパク質分析）は「大きさで分ける（SDS-PAGE）」「特異的に検出する（Western blot・活性染色）」の2軸で読む。 混合物から目的タンパク質を同定・特徴づける。物理的性質physical nature物理的性質（physical nature）physical nature（物理的性質）（分子量）か機能的性質（酵素活性 enzymatic activity）を手がかりにする。実習ではLDHアイソザイムLDH isoenzymeLDHアイソザイム（LDH isoenzyme）LDH isoenzyme（LDHアイソザイム）を電気泳動で分け、組織ごとのパターンを見る。
タンパク質分析の考え方
タンパク質分析protein analysisタンパク質分析（protein analysis）protein analysis（タンパク質分析）は、診断と特徴づけ（characterization）に分かれる。
- 診断: タンパク質混合物や生体試料（血液など）から目的タンパク質を同定。物理的性質physical nature物理的性質（physical nature）physical nature（物理的性質）（分子量 molecular weight）または機能的性質（酵素活性）に基づく。
- 特徴づけ（characterization）: 目的タンパク質を単離・精製purification精製（purification）purification（精製）し、夾雑物のない標品を得る。
SDS-PAGE（電気泳動による分離）
SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）は、タンパク質を大きさ（分子量）だけで分ける最も一般的な方法。
自由溶液中では移動速度は「大きさ・形」と「正味電荷」の両方に依存する。SDS-PAGEはこれを大きさだけに単純化する。
| 試薬・条件 | 英語 | 働き |
|---|---|---|
| SDS（陰イオンanion陰イオン（anion）anion（陰イオン）界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤）） | sodium dodecyl sulphate | タンパク質を変性、大量の負電荷を均一に付与 |
| 還元剤 | β-mercaptoethanol / DTT | ジスルフィド結合disulfide bondジスルフィド結合（disulfide bond）disulfide bond（ジスルフィド結合）（−S−S−）を切断 |
| 加熱（70–90℃） | heating | 完全に直鎖化 |
| ポリアクリルアミドゲル | polyacrylamide gel | 分子ふるいmolecular sieving分子ふるい（molecular sieving）molecular sieving（分子ふるい）（molecular sieving） |
💡 SDSが「電荷/質量比」を一定にする。 SDSはタンパク質1 gあたり約1.4 gも結合し、元の電荷を無視neglect無視（neglect）neglect（無視）できるほどの負電荷で覆う。全タンパク質が同じ電荷/質量比・同じ向き（陽極positive electrode陽極（positive electrode）positive electrode（陽極） anode へ）で動くため、あとはゲルの分子ふるいmolecular sieving分子ふるい（molecular sieving）molecular sieving（分子ふるい）効果だけが速度を決める。電気泳動移動度electrophoretic mobility電気泳動移動度（electrophoretic mobility）electrophoretic mobility（電気泳動移動度）は分子量の対数に反比例して減少する（大きいほど遅い）。
flowchart TD
A["タンパク質混合物"]
A --> B["SDS＋還元剤＋加熱<br>変性・直鎖化・均一な負電荷"]
B --> C["ポリアクリルアミドゲルへ添加"]
C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='electric field'>電場</span>で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='positive electrode'>陽極</span>へ移動<br>大きいほど遅い（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='molecular sieving'>分子ふるい</span>）"]
D --> E["分子量で分離されたバンド"]ウェスタンブロット法（特異的検出）
SDS-PAGEで分けたタンパク質を膜に転写し、抗体で特定のタンパク質を検出するのがウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）。分子量による分離＋抗体による特異性で、目的タンパク質を確認できる。
LDHアイソザイムの電気泳動
乳酸脱水素酵素lactate dehydrogenase, LDH乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase, LDH）lactate dehydrogenase, LDH（乳酸脱水素酵素）は、H型（心筋型 heart）とM型（骨格筋型 muscle）の2種のサブユニットが4つ集まった四量体tetramer四量体（tetramer）tetramer（四量体）。組み合わせで5種のアイソザイムisoenzymeアイソザイム（isoenzyme）isoenzyme（アイソザイム）ができる。
| アイソザイムisoenzymeアイソザイム（isoenzyme）isoenzyme（アイソザイム） | サブユニット構成 | 主な分布 |
|---|---|---|
| LDH-1 | H₄ | 心筋、赤血球 |
| LDH-2 | H₃M | 心筋、赤血球 |
| LDH-3 | H₂M₂ | 肺、脾 |
| LDH-4 | HM₃ | 肝、骨格筋 |
| LDH-5 | M₄ | 肝、骨格筋 |
⭐ アイソザイムisoenzymeアイソザイム（isoenzyme）isoenzyme（アイソザイム）のパターンが「傷んだ臓器」を教える。 同じ反応を触媒するが組織ごとに構成が違うため、血中LDHアイソザイムLDH isoenzymeLDHアイソザイム（LDH isoenzyme）LDH isoenzyme（LDHアイソザイム）パターンから障害臓器を推定できる（例：心筋梗塞でLDH-1上昇）。組織特異的な発現が診断に使われる。
活性染色による検出
実習ではLDHの酵素活性を利用して染色する。ゲルを発色液に浸すと、LDH活性のある位置だけ発色する。
- 基質：NAD⁺ と 乳酸
- 一次電子受容体：フェナジンメトサルフェートphenazine methosulphateフェナジンメトサルフェート（phenazine methosulphate）phenazine methosulphate（フェナジンメトサルフェート）
- 最終電子受容体：テトラゾリウムブルーtetrazolium blueテトラゾリウムブルー（tetrazolium blue）tetrazolium blue（テトラゾリウムブルー）（還元されて発色）
まとめ
- タンパク質分析protein analysisタンパク質分析（protein analysis）protein analysis（タンパク質分析）は「大きさで分ける（SDS-PAGE）」と「特異的に検出（Western blot・活性染色）」。
- SDS-PAGEはSDSで変性・均一な負電荷を付与し、分子ふるいmolecular sieving分子ふるい（molecular sieving）molecular sieving（分子ふるい）で大きさだけで分離。移動度mobility移動度（mobility）mobility（移動度）は分子量の対数に反比例。
- 還元剤（β-メルカプトエタノール/DTT）でS−S結合を切断する。
- LDHはH型・M型サブユニットの四量体tetramer四量体（tetramer）tetramer（四量体）で5アイソザイムisoenzymeアイソザイム（isoenzyme）isoenzyme（アイソザイム）。組織特異的パターンが診断に有用。
- 実習ではNAD⁺/乳酸を基質とする活性染色でLDHを検出する。