蛍光顕微鏡

🧠 蛍光顕微鏡fluorescence microscope 蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡） は、特定分子だけに蛍光標識 fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label） fluorescent label（蛍光標識） を結合し、励起光excitation light 励起光（excitation light）excitation light（励起光） と発光を波長で分けることで、明るい背景中の形ではなく分子局在を可視化する。

落射蛍光の光路

flowchart TD
  A["光源"] --> B["励起<span class='jp-term jp-term-diagram' title='barrier'>フィルター</span>"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='dichroic mirror'>ダイクロイックミラー</span>で反射"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='objective lens'>対物レンズ</span>から試料を励起"]
  D --> E["長波長の蛍光を同じ対物で回収"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='dichroic mirror'>ダイクロイックミラー</span>を透過"]
  F --> G["発光<span class='jp-term jp-term-diagram' title='barrier'>フィルター</span>"]
  G --> H["眼・<span class='jp-term jp-term-diagram' title='camera'>カメラ</span>で像を形成"]

ダイクロイックミラーdichroic mirror ダイクロイックミラー（dichroic mirror）dichroic mirror（ダイクロイックミラー） は短波長の励起光 excitation light 励起光（excitation light） excitation light（励起光） を反射し、長波長側の蛍光を透過させる。

コントラストの由来

標識分子marker molecule 標識分子（marker molecule）marker molecule（標識分子） が存在する場所だけが発光するため、形態染色とは異なる分子特異性を得られる。複数の蛍光色素 fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素） では、励起・発光帯域の重なりと漏れ込みを考慮する。色素間の近接を測る場合はFRETを利用できる。

画質を制限する現象

焦点外蛍光は像をぼかし、強い照明は光退色 photobleaching 光退色（photobleaching） photobleaching（光退色） と光毒性 phototoxicity 光毒性（phototoxicity） phototoxicity（光毒性） を生む。退色blanching 退色（blanching）blanching（退色） を単なる欠点で終わらせず分子移動の測定へ使う方法がFRAPである。

⚠️ 明るさの差は分子量の差だけでなく、照明むら、焦点、量子収率、退色blanching 退色（blanching）blanching（退色） にも左右される。

まとめ

励起状態からの緩和、発光、測定値の解釈は、蛍光の時間依存性 time-dependent 時間依存性（time-dependent） time-dependent（時間依存性） と実験条件を併せて考える。¹²

• 励起フィルター barrierフィルター（barrier） barrier（フィルター）、ダイクロイックミラーdichroic mirrorダイクロイックミラー（dichroic mirror）dichroic mirror（ダイクロイックミラー）、発光フィルター barrier フィルター（barrier） barrier（フィルター） が光を分離する。
• 蛍光標識fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識） により特定分子の局在を高コントラスト contrast コントラスト（contrast） contrast（コントラスト） で示せる。
• 定量画像では焦点外光、漏れ込み、退色blanching退色（blanching）blanching（退色）、光毒性phototoxicity 光毒性（phototoxicity）phototoxicity（光毒性） を管理する。