Immunology · 10.4

フローサイトメトリー（手法 III）

Flow cytometry (Methods III)

タグ: W5Seminar / 演習

🧠 フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）は「1細胞ずつ・多パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）で・高速に」を同時に実現する検査法として読む。 1回の測定で10⁵〜10⁶個もの細胞を解析でき、微小残存病変measurable residual disease, MRD微小残存病変（measurable residual disease, MRD）measurable residual disease, MRD（微小残存病変）のような稀な細胞集団も検出できる代わりに、高価で専門性の高い装置・人材を要する。原理は単純——毛細管内を一列に並んだ細胞がレーザー光を横切り、散乱光scattered light散乱光（scattered light）scattered light（散乱光）（サイズ・顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度））と蛍光（抗体標識）を同時に検出する。

利点と欠点

利点	欠点
1回の測定で大量の細胞（10⁵〜10⁶）を解析——稀少な細胞集団（例：微小残存病変measurable residual disease, MRD微小残存病変（measurable residual disease, MRD）measurable residual disease, MRD（微小残存病変）、MRD）も検出可能	装置が非常に高価・高度
個々の細胞を検出できる	高度な訓練を受けた専門家expert専門家（expert）expert（専門家）による運用と、サービスエンジニアによる継続的な保守が必要
多パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）測定（FL1〜多数）	単一細胞の浮遊buoyancy浮遊（buoyancy）buoyancy（浮遊）液が必要（組織のまま測定できない）
ソーティングcell sortingソーティング（cell sorting）cell sorting（ソーティング）（細胞選別）が可能	—

原理：光散乱と蛍光の同時検出

毛細管内でレーザービームの前を細胞が一列に並んで通過する。前方散乱光forward scatter, FSC前方散乱光（forward scatter, FSC）forward scatter, FSC（前方散乱光）は相対的な細胞サイズを、側方散乱光side scatter, SSC側方散乱光（side scatter, SSC）side scatter, SSC（側方散乱光）は顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度）を反映する。

⭐ FSC/SSCの散乱図だけで、リンパ球・単球・顆粒球を大まかに区別できる。 サイズと顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度）という2つの物理的パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）だけで、リンパ球（小型・低顆粒hypogranulation低顆粒（hypogranulation）hypogranulation（低顆粒）度）・単球（中型）・好中球/好酸球/好塩基球basophil好塩基球（basophil）basophil（好塩基球）（大型・高顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度））という白血球サブセットが散布図上で異なる領域に分離する——抗体標識なしでも得られる、最初のふるい分け。

ゲーティング

ゲーティングgatingゲーティング（gating）gating（ゲーティング）＝細胞集団の定義。代表的なゲーティングgatingゲーティング（gating）gating（ゲーティング）マーカー：CD45（白血球共通抗原、leukocyte common antigen、タンパクチロシンホスファターゼ）ですべての白血球を選別し、CD14（細菌リポ多糖lipopolysaccharide (LPS)リポ多糖（lipopolysaccharide (LPS)）lipopolysaccharide (LPS)（リポ多糖）の共受容体co-receptor共受容体（co-receptor）co-receptor（共受容体）、主にマクロファージ・単球に発現）でさらに単球系monocytic単球系（monocytic）monocytic（単球系）を絞り込む。

免疫表現型検査が答える3つの問い

問い	測定パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）
その抗原は発現しているか？（Yes/No）	陽性/陰性の判定
何%の細胞がその分子を発現しているか？	陽性細胞の割合
細胞あたりどれだけ抗原が存在するか？	発現量（蛍光強度）

💡 ヒストグラムの「山の位置」と「山の高さ」は違う情報を示す。 2つの検体を比較する古典的な教育例：山が左にシフトすれば「1細胞あたりの抗原発現量が少ない」ことを、山の高さ（陽性細胞の割合）が変われば「抗原を発現する細胞の比率が違う」ことを意味する——同じ「差」でも解釈すべき軸が異なる。自家蛍光autofluorescence自家蛍光（autofluorescence）autofluorescence（自家蛍光）や非特異的結合aspecific binding非特異的結合（aspecific binding）aspecific binding（非特異的結合）もこの判定を妨げる要因になる。

⚠️ CD4は健常者でもリンパ球だけに発現するわけではない。 リンパ球ではCD4が高発現（CD4^high+）だが、単球でも低発現（CD4^dim+）している——同じマーカーでも細胞種により発現「量」が異なり、これを見分けるにも定量的な蛍光強度の評価が必要になる。2色の蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）を同時に使うことで、共発現co-expression共発現（co-expression）co-expression（共発現）解析（例：CD3×CD4のドットプロット）が可能になる。

リンパ球サブセットパネル

CD3・CD4・CD8・CD19・CD56などの組み合わせでT・B・NK・Tc・Th・Treg・形質細胞などのサブセットを識別する（01-2-the-immune-system-in-the-labのCD marker表も参照）。細胞内サイトカイン（IFN-γ・IL-4・IL-17等）の同時検出により、機能的な特徴づけ（Th1/Th2/Th17の判別など）も可能——ただし細胞内分子intracellular molecule細胞内分子（intracellular molecule）intracellular molecule（細胞内分子）の検出には透過処理permeabilization透過処理（permeabilization）permeabilization（透過処理）を要する。

ソーティング

帯電させた液滴を静電場electric field電場（electric field）electric field（電場）で偏向させることで、蛍光シグナルに基づいて生きた細胞を物理的に分離・回収できる（FACFunctional Ambulation CategoryFAC（Functional Ambulation Category）Functional Ambulation Category（FAC）S：fluorescence-activated cell sorting）。

臨床応用

分類	適応
絶対適応	造血器悪性腫瘍hematological malignancy造血器悪性腫瘍（hematological malignancy）hematological malignancy（造血器悪性腫瘍）の診断・鑑別診断differential diagnosis鑑別診断（differential diagnosis）differential diagnosis（鑑別診断）、微小残存病変measurable residual disease, MRD微小残存病変（measurable residual disease, MRD）measurable residual disease, MRD（微小残存病変）の検出、薬剤耐性antimicrobial resistance, AMR薬剤耐性（antimicrobial resistance, AMR）antimicrobial resistance, AMR（薬剤耐性）、移植後経過観察、免疫不全の診断・鑑別診断differential diagnosis鑑別診断（differential diagnosis）differential diagnosis（鑑別診断）、生物学的製剤の適応判定・経過観察
相対適応	自己免疫疾患、HLA関連、感染症診断、感染による免疫応答、細胞周期解析（悪性腫瘍）、機能解析、受容体発現

分類

適応

絶対適応

造血器悪性腫瘍hematological malignancy造血器悪性腫瘍（hematological malignancy）hematological malignancy（造血器悪性腫瘍）の診断・鑑別診断differential diagnosis鑑別診断（differential diagnosis）differential diagnosis（鑑別診断）、微小残存病変measurable residual disease, MRD微小残存病変（measurable residual disease, MRD）measurable residual disease, MRD（微小残存病変）の検出、薬剤耐性antimicrobial resistance, AMR薬剤耐性（antimicrobial resistance, AMR）antimicrobial resistance, AMR（薬剤耐性）、移植後経過観察、免疫不全の診断・鑑別診断differential diagnosis鑑別診断（differential diagnosis）differential diagnosis（鑑別診断）、生物学的製剤の適応判定・経過観察

相対適応

自己免疫疾患、HLA関連、感染症診断、感染による免疫応答、細胞周期解析（悪性腫瘍）、機能解析、受容体発現

症例：多発性骨髄腫の免疫表現型解析

造血器悪性腫瘍hematological malignancy造血器悪性腫瘍（hematological malignancy）hematological malignancy（造血器悪性腫瘍）の診断は、症状・形態学的検査（血算、骨髄塗抹・生検）・細胞化学・血清学・フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）・染色体/分子遺伝学を組み合わせて行う（10-2-immunoserology-methods-iの多発性骨髄腫multiple myeloma, MM多発性骨髄腫（multiple myeloma, MM）multiple myeloma, MM（多発性骨髄腫）症例も参照）。

⭐ EuroFlowパネルは形質細胞の悪性度を1回の測定で読み解く多色パネル。 CD138/CD27/CD38/CD56/CD45/CD19/CD117/CD81などを組み合わせ、骨髄腫細胞myeloma cell骨髄腫細胞（myeloma cell）myeloma cell（骨髄腫細胞）に特徴的な表現型（CD19陰性・CD56強陽性・CD45陰性・CD138陽性など、正常形質細胞とは異なるパターン）を検出する。

B細胞分化段階のCDマーカーパネル

前駆B細胞precursor B cell前駆B細胞（precursor B cell）precursor B cell（前駆B細胞）（Pro-B：CD34+CD19+TdT+）→前B細胞（Pre-B：CD10+ic CD22+）→未成熟B細胞→成熟B細胞→活性化B細胞→形質細胞という分化段階を、それぞれ特徴的なCDマーカーの組み合わせで識別できる（05-3-b-lymphocytes-and-the-humoral-immune-responseの発生段階developmental stages発生段階（developmental stages）developmental stages（発生段階）も参照）。骨髄内Intraosseous骨髄内（Intraosseous）Intraosseous（骨髄内）は抗原非依存的、末梢では抗原依存的な分化が進む。

症例：HIV/AIDSにおけるCD4モニタリング

健常者ではリンパ球中のCD4+細胞は20〜40%を占める。14%未満は重度の免疫障害を示唆する。HIVは主にCD4+ Th細胞に感染するため、CD4+/CD8+比の算出が重要——免疫不全症immunodeficiency免疫不全症（immunodeficiency）immunodeficiency（免疫不全症）候群の患者ではCD4陽性T細胞数が減少する。フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）はこの定量的モニタリングに適している。

機能解析への応用

フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）はサイトカイン産生・細胞傷害活性cytotoxic activity細胞傷害活性（cytotoxic activity）cytotoxic activity（細胞傷害活性）・活性酸素中間体reactive oxygen intermediate (ROI)活性酸素中間体（reactive oxygen intermediate (ROI)）reactive oxygen intermediate (ROI)（活性酸素中間体）産生・シグナル伝達・貪食能phagocytic capacity貪食能（phagocytic capacity）phagocytic capacity（貪食能）・薬剤耐性antimicrobial resistance, AMR薬剤耐性（antimicrobial resistance, AMR）antimicrobial resistance, AMR（薬剤耐性）といった細胞機能の解析にも使われる（校正proofreading校正（proofreading）proofreading（校正）ビーズ・アイソタイプisotypeアイソタイプ（isotype）isotype（アイソタイプ）対照を併用）。

💡 単球のHLA-DR発現量は敗血症患者の予後を予測する。 高い単球HLA-DR発現は敗血症患者の良好な転帰を予測する——相対発現量だけでなく絶対発現量の経時的変化serial change経時的変化（serial change）serial change（経時的変化）（1回目・2回目の採血比較）を追うことに臨床的意義がある。サイトカインビーズアレイは、抗サイトカイン抗体を結合させたマイクロビーズと、蛍光標識fluorescent label蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識）抗サイトカイン抗体を組み合わせたサンドイッチ法sandwich method (immunoassay)サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法）で、可溶性サイトカインを検出する。

まとめ

フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）は1細胞ずつ多パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）で解析する高速検査法で、稀少細胞集団の検出に強い反面、高価で専門性を要する。
FSC（サイズ）・SSC（顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度））の散乱光scattered light散乱光（scattered light）scattered light（散乱光）だけで白血球サブセットを大まかに区別でき、CD45/CD14などのゲーティングgatingゲーティング（gating）gating（ゲーティング）マーカーでさらに細胞集団を絞り込む。
免疫表現型検査immunophenotyping免疫表現型検査（immunophenotyping）immunophenotyping（免疫表現型検査）は「発現の有無」「陽性率」「発現量」という3つの問いに答え、ヒストグラムのシフト（発現量の変化）とピーク高（陽性率の変化）は異なる意味をもつ。
リンパ球サブセットパネルlymphocyte subpopulation panelリンパ球サブセットパネル（lymphocyte subpopulation panel）lymphocyte subpopulation panel（リンパ球サブセットパネル）・B細胞分化cell differentiation細胞分化（cell differentiation）cell differentiation（細胞分化）段階パネル・EuroFlow骨髄腫パネルなど、疾患特異的disease-specific疾患特異的（disease-specific）disease-specific（疾患特異的）な多色パネルが臨床診断に応用される。
HIV/AIDSのCD4モニタリング、敗血症の単球HLA-DR発現、サイトカインビーズアレイなど、定量的モニタリングと機能解析の両面でフローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）は中心的な役割を果たす。