イムノアッセイ（手法 II）

🧠 免疫測定法immunoassay免疫測定法（immunoassay）immunoassay（免疫測定法）は「検体の種類」で手法が決まる、と読む。 体液検体→ELISA・ラテラルフローlateral flowラテラルフロー（lateral flow）lateral flow（ラテラルフロー）・RIA/IRMA、単離タンパク検体→ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）、固形組織検体→免疫組織化学immunohistochemistry (IHC)免疫組織化学（immunohistochemistry (IHC)）immunohistochemistry (IHC)（免疫組織化学）（免疫蛍光immunofluorescence, IF免疫蛍光（immunofluorescence, IF）immunofluorescence, IF（免疫蛍光））。いずれも抗原抗体反応antigen-antibody reaction抗原抗体反応（antigen-antibody reaction）antigen-antibody reaction（抗原抗体反応）という同じ土台の上に、検出方法（酵素発色・放射性標識・蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素））だけが異なる。

診断法の統計学的特性

感度＝真の患者のうち検査陽性となる者の割合。特異度＝健常者のうち検査陰性となる者の割合。

ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）— 3つの主要な型

flowchart TD
  A["ELISAの3型"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='indirect'>間接法</span><br>コーティング→洗浄→ブロッキング→検体中の1次抗体→2次抗体（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='enzyme label'>酵素標識</span>）→発色基質"]
  A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sandwich method (immunoassay)'>サンドイッチ法</span><br>捕捉抗体＋検出抗体で抗原を挟み込む"]
  A --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competitive'>競合法</span><br>抗原量と発色強度が逆相関"]

⭐ 競合ELISAは「発色が強いほど抗原が少ない」という直感に反する関係をもつ。 検体中に抗原が多いほど、標識抗原labeled antigen標識抗原（labeled antigen）labeled antigen（標識抗原）と検体中の抗原が結合部位を奪い合い遊離抗体free antibody遊離抗体（free antibody）free antibody（遊離抗体）が減少し発色は弱くなる。逆に抗原が少なければ遊離抗体free antibody遊離抗体（free antibody）free antibody（遊離抗体）が多く残り発色は強くなる——この逆相関性により、可溶性抗原soluble antigen可溶性抗原（soluble antigen）soluble antigen（可溶性抗原）の微量検出に特に有用。

ELISAの臨床応用（多岐にわたるパネル検査）

💡 感染症診断では「ウイルスそのもの」ではなく「ウイルスに対する抗体」を測ることが多い。 活性化B細胞が形質細胞へ分化し抗ウイルス性ポリクローナル抗体polyclonal antibodyポリクローナル抗体（polyclonal antibody）polyclonal antibody（ポリクローナル抗体）を産生する——この抗体を体液から検出することが、ウイルス粒子を直接検出するよりも実務上の標準になっている。

結核診断とQuantiFERON試験

Th細胞・記憶T細胞がツベルクリンtuberculinツベルクリン（tuberculin）tuberculin（ツベルクリン）抗原刺激でIFN-γを産生する→ELISAでIFN-γを検出（QuantiFERON試験）。1mLの血液を3本のチューブtubeチューブ（tube）tube（チューブ）（結核抗原nuclear antigen核抗原（nuclear antigen）nuclear antigen（核抗原）ペプチド3種）で刺激培養し、血漿中に放出されたIFN-γをELISAで測定——24時間以内に結果が出て、特別な検査室基盤を必要としない利点をもつ（07-3-hypersensitivity-ii-ivのツベルクリン反応tuberculin reaction (Mantoux test)ツベルクリン反応（tuberculin reaction (Mantoux test)）tuberculin reaction (Mantoux test)（ツベルクリン反応）も参照）。

症例：HIV診断（ELISA＋ウェスタンブロットによる確認）

35歳女性、一時的な交際相手が2人。HIV陽性か？陽性なら相手に感染させた可能性は？——間接ELISAで抗HIV IgG抗体を検出し、陽性例はウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）で確認するという2段階アルゴリズムをたどる。

⚠️ ELISAの各ステップを飛ばすと、何が起こるかを推論できることが理解度を測る。 二次抗体（抗ヒトIg結合体）を洗い流さずに基質を加えれば、全ウェルが等しく強い発色を示してしまう（洗浄不足→非特異的シグナル）。逆に検体（患者血清）を加え忘れた場合、抗ヒトIg結合体は結合できず洗浄で除去されるため、発色は起こらない——「陰性に見えるが手技ミスによる偽陰性」を見抜く視点が重要。

ウェスタンブロット法

①タンパクをSDS-PAGE（ドデシルdodecylドデシル（dodecyl）dodecyl（ドデシル）硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動））でサイズ分離、②膜へ転写、③免疫検出（immunodetection：患者血清を1次抗体として、あらかじめ膜上に固定されたウイルスタンパクと反応させる）。

⭐ HIVウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）の判定基準は「コアタンパクcore proteinコアタンパク（core protein）core protein（コアタンパク）と外被タンパクの両方」を要求する。 バンドなし＝陰性。p31またはp24（コアタンパクcore proteinコアタンパク（core protein）core protein（コアタンパク））と、gp160またはgp120（外被糖タンパク）のバンドが同時に存在して初めて陽性——片方だけでは判定不能indeterminate判定不能（indeterminate）indeterminate（判定不能）というルールが、偽陽性を減らす仕組みになっている。

ラテラルフロー技術（迅速イムノクロマト法）

単一ステップの免疫クロマトグラフィーimmune chromatography, IC免疫クロマトグラフィー（immune chromatography, IC）immune chromatography, IC（免疫クロマトグラフィー）検査（イムノクロマト法immunochromatographyイムノクロマト法（immunochromatography）immunochromatography（イムノクロマト法））は数分で結果が出る（従来法は数時間）、安価で検査室の専門知識を要さない。

応用例： HIV、モルヒネ（尿検査）、ヘリコバクター・ピロリHelicobacter pyloriピロリ（Helicobacter pylori）Helicobacter pylori（ピロリ）抗体/便中抗原stool antigen便中抗原（stool antigen）stool antigen（便中抗原）、尿中hCG（妊娠検査）、ライム病病原体抗体、小麦粉のグルテンglutenグルテン（gluten）gluten（グルテン）含量測定。

抗原検出型ラテラルフロー

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nasopharynx'>鼻咽頭</span>検体を溶解緩衝液に投入<br>ウイルスタンパクを細胞外に放出"]
  A --> B["抗Sタンパク抗体で被覆した着色微粒子と混合"]
  B --> C["検体中のS/N抗原が微粒子上の抗体に結合"]
  C --> D["テストラインの別エピトープ特異的抗体に捕捉 → 発色"]
  D --> E["コントロールライン（抗ヒトIg抗体）で手技の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='validity'>妥当性</span>を確認"]

抗体検出型ラテラルフロー

病原体に対するIgM・IgG抗体を検出する。IgMは感染後平均7日、IgGは平均14日で出現する。

⚠️ IgM・IgG両方陰性でも「感染していない」とは言い切れない——ウィンドウ期window periodウィンドウ期（window period）window period（ウィンドウ期）の罠。 IgM−/IgG−は抗体が検出限界limit of detection検出限界（limit of detection）limit of detection（検出限界）以下なだけで、現在の感染を除外する根拠にはならない（ウィンドウ期window periodウィンドウ期（window period）window period（ウィンドウ期））。IgM+/IgG−またはIgM+/IgG+は現在の感染を示唆し、IgM−/IgG+は既感染を示唆する——この4パターンの解釈を誤ると、急性期の感染者を「陰性」と誤診misdiagnosis誤診（misdiagnosis）misdiagnosis（誤診）しかねない。

免疫放射定量法と放射免疫測定法

💡 測定法の感度は「下限検出限界limit of detection検出限界（limit of detection）limit of detection（検出限界）」で比較でき、現在ではRIA/ELISAより質量分析法mass spectrometry質量分析法（mass spectrometry）mass spectrometry（質量分析法）の方が高感度になっている。 コルチゾール測定を例にとると、蛍光測定法（最も低感度）→酵素免疫測定法enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)酵素免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)）enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)（酵素免疫測定法）→蛍光偏光polarized light偏光（polarized light）polarized light（偏光）法/液体クロマトグラフィーchromatographyクロマトグラフィー（chromatography）chromatography（クロマトグラフィー）→HPLChigh-performance liquid chromatographyHPLC（high-performance liquid chromatography）high-performance liquid chromatography（HPLC）→RIA→ELISA→同位体isotope同位体（isotope）isotope（同位体）希釈GC-MSgas chromatography-mass spectrometryGC-MS（gas chromatography-mass spectrometry）gas chromatography-mass spectrometry（GC-MS）→LC-MS/MSliquid chromatography-tandem mass spectrometryLC-MS/MS（liquid chromatography-tandem mass spectrometry）liquid chromatography-tandem mass spectrometry（LC-MS/MS）（最高感度）という順に検出限界limit of detection検出限界（limit of detection）limit of detection（検出限界）が向上する——放射性同位体radioisotope (radioactive isotope)放射性同位体（radioisotope (radioactive isotope)）radioisotope (radioactive isotope)（放射性同位体）を用いる古典的手法が、必ずしも最高感度とは限らない時代になっている。

免疫組織化学と免疫蛍光法

直接法direct IH直接法（direct IH）direct IH（直接法）と間接法indirect IH間接法（indirect IH）indirect IH（間接法）があり、一般に組織切片tissue section組織切片（tissue section）tissue section（組織切片）上の抗原を検出する（例：膵組織切片tissue section組織切片（tissue section）tissue section（組織切片）上のインスリン分泌細胞insulin-secreting cellインスリン分泌細胞（insulin-secreting cell）insulin-secreting cell（インスリン分泌細胞）の同定）。

⭐ 免疫蛍光法immunofluorescence assay (IFA)免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)）immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法）では「抗原」が実は抗体そのものであることがある——自己抗体検出antibody detection抗体検出（antibody detection）antibody detection（抗体検出）の逆説paradox逆説（paradox）paradox（逆説）。 培養肝細胞上で患者血清中の抗RNP（核リボ核タンパク）自己抗体を検出する場合、検出対象（＝「抗原」的に扱われるもの）は患者自身の抗体である。ANAスクリーニング（間接蛍光抗体法indirect immunofluorescence assay (IFA)間接蛍光抗体法（indirect immunofluorescence assay (IFA)）indirect immunofluorescence assay (IFA)（間接蛍光抗体法）、08-3-screening-methods-for-autoantibodies参照）はまさにこの原理に基づく——1:40陽性・1:160で判定確定という力価判定と、その後のELISAパネル（SSA/SSB/Scl-70/Jo-1/Sm/RNP/ヒストン/dsDNA等）による特異抗体同定antibody identification抗体同定（antibody identification）antibody identification（抗体同定）が、実際の臨床検査レポートでも連動して運用されている。

検体別・手法まとめ

まとめ

• ELISAは間接法・サンドイッチ法sandwich method (immunoassay)サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法）・競合法competitive assay競合法（competitive assay）competitive assay（競合法）の3型があり、競合法competitive assay競合法（competitive assay）competitive assay（競合法）は「抗原が多いほど発色が弱い」という逆相関性ゆえに微量抗原の検出に向く。自己免疫・内分泌・腫瘍・感染症と極めて広範なパネル検査に応用される。
• HIV診断はELISA（スクリーニング）→ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）（確認、p24/p31＋gp120/gp160の同時陽性が判定基準）という2段階アルゴリズムをとり、手技ミス（洗浄不足・検体添加忘れ）の帰結を推論できることが理解の鍵。
• ラテラルフロー法lateral flow assayラテラルフロー法（lateral flow assay）lateral flow assay（ラテラルフロー法）は数分で結果が出る迅速検査で、抗原検出（現在の感染）と抗体検出antibody detection抗体検出（antibody detection）antibody detection（抗体検出）（IgM/IgG、ウィンドウ期window periodウィンドウ期（window period）window period（ウィンドウ期）に注意）の2種類があり、後者は出現時期（IgM約7日、IgG約14日）を踏まえた解釈を要する。
• RIA（競合法competitive assay競合法（competitive assay）competitive assay（競合法）、抗原量とシグナル逆相関）とIRMA（サンドイッチ法sandwich method (immunoassay)サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法）、抗原量とシグナル正相関)は対照的な原理をもち、現在では質量分析法mass spectrometry質量分析法（mass spectrometry）mass spectrometry（質量分析法）がこれらを凌ぐ感度を実現している。
• 免疫組織化学immunohistochemistry (IHC)免疫組織化学（immunohistochemistry (IHC)）immunohistochemistry (IHC)（免疫組織化学）・免疫蛍光immunofluorescence, IF免疫蛍光（immunofluorescence, IF）immunofluorescence, IF（免疫蛍光）は固形組織上の抗原（または自己抗体を「抗原」として扱う自己抗体検出antibody detection抗体検出（antibody detection）antibody detection（抗体検出））を検出し、ANAスクリーニングとELISA特異抗体パネルの連動運用はその臨床応用clinical applications臨床応用（clinical applications）clinical applications（臨床応用）の典型例。