Molecular Cell Biology · 35

ヒト遺伝子治療の原理（in vivo法とex vivo法、遺伝子付加、CRISPR/Cas9システム）（EM学生のみ）

Principles of human gene therapy (in vivo vs. ex vivo methods, gene augmentation, CRISPR/Cas9 system) (only for EM-students)

🧠 遺伝子治療の全戦略は「治療用遺伝子をどこで細胞に入れるか（体内 in vivo か、体外 ex vivo か）」と「どう運ぶか（ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター） vs 非ウイルスベクターNon-viral vectors非ウイルスベクター（Non-viral vectors）Non-viral vectors（非ウイルスベクター））」という2つの軸の組み合わせで整理できる。 CRISPR/Cas9は、この運搬問題とは独立した「編集そのものの精密さ」を提供する技術であり、細菌が獲得したウイルスへの適応免疫adaptive適応免疫（adaptive）adaptive（適応免疫）記憶（CRISPR配列）を、Cas9という分子のハサミを導くガイドRNAとして転用したものである。

遺伝子治療とは

遺伝子治療とは、疾患を治療または予防するために遺伝子を用いる実験的技術である。

一般的戦略：

疾患の遺伝的原因genetic origin遺伝的原因（genetic origin）genetic origin（遺伝的原因）を同定する
実験室でその問題への遺伝的な修正法を作る
この遺伝的修正を病気の患者体内の細胞へ導入する送達システムを設計する

生体内遺伝子治療

遺伝子が患者の体内にいる状態のまま細胞へ導入される。

個々の細胞をin vitroで十分な数まで培養できない場合（例：脳細胞）に適用される
培養した（治療用）細胞を効率的に移植/再移植できない場合に必要となる

ex vivo遺伝子治療

修正対象患者からの細胞単離→細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）→治療用遺伝子の導入→遺伝的に修正された細胞の選択・培養→修正された細胞を患者へ移植。

遺伝子治療のベクター

ベクターは治療用遺伝子を標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）へ移すために必要な運び手である。2つの主要な型がある：ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）と非ウイルスベクターNon-viral vectors非ウイルスベクター（Non-viral vectors）Non-viral vectors（非ウイルスベクター）。

ウイルスベクター

ウイルスが細胞に感染することで新規遺伝子を送達するが、疾患を引き起こさないよう改変されている。最も効果的だが、その免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）・発癌性・DNAサイズの小ささにより制限を受ける。

ベクター系	特徴
レトロウイルスベクターRetrovirus vectorsレトロウイルスベクター（Retrovirus vectors）Retrovirus vectors（レトロウイルスベクター）系	一本鎖RNAsingle-stranded RNA一本鎖RNA（single-stranded RNA）single-stranded RNA（一本鎖RNA）ゲノム。組換えベクターとして宿主細胞ゲノムへ強固に組み込まれうる。DNA長は最大3.4 kb。ウイルス粒子自体は複製できない。標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）は分裂中の細胞型
アデノウイルスベクターadenoviral vectorアデノウイルスベクター（adenoviral vector）adenoviral vector（アデノウイルスベクター）系	長い線状二本鎖DNAゲノム。最大挿入サイズ約7 kb。宿主ゲノムへの組み込みなし。強い免疫応答を誘発する。分裂中・非分裂中細胞の両方を標的とする
アデノ随伴ウイルスベクターAdeno-associated virus, AAVアデノ随伴ウイルスベクター（Adeno-associated virus, AAV）Adeno-associated virus, AAV（アデノ随伴ウイルスベクター）系	小さな一本鎖DNAsingle-stranded DNA一本鎖DNA（single-stranded DNA）single-stranded DNA（一本鎖DNA）。染色体19番へ組み込み可能。非病原性apathogenic非病原性（apathogenic）apathogenic（非病原性）。免疫応答なし。宿主細胞へ入り二本鎖化・組み込みされる。挿入サイズ最大5 kb
単純ヘルペスウイルスherpes simplex virus, HSV単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus, HSV）herpes simplex virus, HSV（単純ヘルペスウイルス）ベースベクター	二本鎖DNA。挿入サイズは20 kb超可能。主にニューロン向け遺伝子送達用に開発されてきた。特定の細胞型に感染する自然の傾向を持つ。宿主ゲノムへの組み込みなし

非ウイルスベクター

ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）より毒性・免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）が低いベクター。より安全で再現性が高く、DNAサイズの制限がない。

方法	特徴
純粋DNA構築物	DNA構築物を組織へ直接導入——効率が低いため多量のDNAを要する
リポプレックスlipoplexリポプレックス（lipoplex）lipoplex（リポプレックス）	脂質-DNA複合体：DNA構築物が人工脂質層lipid layer脂質層（lipid layer）lipid layer（脂質層）に囲まれる。大部分はリソソームにより分解される
DNA分子複合体	一般的な複合体：ポリ-L-リジン——特異的標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）受容体に結合し、治療用DNAが複合体と組み合わさり複合体を形成、リソソームによる分解を受けない
ヒト人工染色体	大きなDNAを運搬でき、調節要素とともにより多くの遺伝子を搭載できる

遺伝子送達の方法：

物理的方法：遺伝子銃（gene gun、元々は植物形質転換用に設計、外来DNA（トランスジーン）を細胞へ送達するために重金属heavy metals重金属（heavy metals）heavy metals（重金属）の微粒子（金、DNAでコーティング）を用いる）、マイクロインジェクションmicroinjectionマイクロインジェクション（microinjection）microinjection（マイクロインジェクション）、エレクトロポレーションelectroporationエレクトロポレーション（electroporation）electroporation（エレクトロポレーション）。

化学的方法：界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤）混合物（リン酸カルシウムcalcium phosphateリン酸カルシウム（calcium phosphate）calcium phosphate（リン酸カルシウム）-cDNA混合物——細胞膜が乱され孔径pore size孔径（pore size）pore size（孔径）が広がりcDNAが細胞内へ入る）、リポフェクションlipofectionリポフェクション（lipofection）lipofection（リポフェクション）（人工リン脂質小胞であるリポソームliposomeリポソーム（liposome）liposome（リポソーム）を用いてDNAを細胞内へ入れる）。

遺伝子付加

目標： 遺伝子の機能喪失により引き起こされる疾患の場合→正常な遺伝子産物量を、正常な表現型が回復するレベルまで増加させる。

遺伝子治療の最も一般的な形式
病態形成（疾患の発生）が可逆的な疾患のみに適用可能
特に常染色体劣性autosomal recessive常染色体劣性（autosomal recessive）autosomal recessive（常染色体劣性）疾患に応用される——導入された遺伝子のわずかな発現レベルでも大きな違いを生みうるため
例：導入遺伝子の機能的コピーfunctional copy機能的コピー（functional copy）functional copy（機能的コピー）を導入することで疾患を修正する嚢胞性線維症などの機能喪失疾患の治療に用いられうる

CRISPR/Cas9システム

CRISPR/Cas9システムは、ゲノムの一部を編集するために用いられる技術であり、CRISPR部分がCas9酵素（分子のハサミ）を標的DNA区間へ導く。その後、両者が協働して遺伝子を不活性化/修復するか、Cas9のハサミが切断を加えた場所に新しいものを挿入する。

CRISPR： クラスターclusterクラスター（cluster）cluster（クラスター）化して規則的に間隔配置された短い回文配列palindromic sequence回文配列（palindromic sequence）palindromic sequence（回文配列） Cas9： CRISPR関連ヌクレアーゼ9（CRISPR associated nuclease 9）

反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）は通常20〜25 bp長の回文palindrome (palindromic sequence)回文（palindrome (palindromic sequence)）palindrome (palindromic sequence)（回文）反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）で、大腸菌（細菌）ゲノム中にスペーサーspacerスペーサー（spacer）spacer（スペーサー）（短い統合ウイルスDNA）を間に挟んで見出される。このシステムはウイルス感染に対する遺伝的記憶素子——外来遺伝要素に対する適応免疫adaptive適応免疫（adaptive）adaptive（適応免疫）——を持つ細菌に由来する。これらは2回目の感染時にウイルスを検出・破壊する。

機序

免疫化フェーズ： 細菌がウイルスに初めて遭遇したとき

攻撃するウイルスが細菌細胞bacteria細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞）内へDNAを注入する
細菌はウイルスDNAを捕獲capture (electron/neutron capture)捕獲（capture (electron/neutron capture)）capture (electron/neutron capture)（捕獲）し、Cas1・Cas2と呼ばれるタンパク質により切断する（切断はPAM配列——プロトスペーサーprotospacer (as in PAM, protospacer adjacent motif)プロトスペーサー（protospacer (as in PAM, protospacer adjacent motif)）protospacer (as in PAM, protospacer adjacent motif)（プロトスペーサー）隣接モチーフ——で起こる）
切断されたDNA断片はCRISPR座位にスペーサーspacerスペーサー（spacer）spacer（スペーサー）として組み込まれる→crRNA（CRISPR RNA）を作る
構造：反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）｜スペーサーspacerスペーサー（spacer）spacer（スペーサー）｜反復配列repetitive sequence反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列）｜スペーサーspacerスペーサー（spacer）spacer（スペーサー）…と続く

攻撃ウイルスDNAの不活性化フェーズ： 細菌がウイルスに2回目に遭遇したとき

flowchart TD
  A["細菌ゲノムからCRISPR RNAの転写"] --> B["トランス活性化RNAがpre-CRISPR RNA配列と<span class='jp-term jp-term-diagram' title='base pairing'>塩基対合</span>→RNA二<span class='jp-term jp-term-diagram' title='heavy chain'>重鎖</span>形成"]
  B --> C["RNA二<span class='jp-term jp-term-diagram' title='heavy chain'>重鎖</span>が切断されトランス活性化RNAとCRISPR RNAの<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hybrid'>ハイブリッド</span>を形成"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hybrid'>ハイブリッド</span>が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='endonuclease'>エンドヌクレアーゼ</span>Cas9のガイドとして機能"]
  D --> E["Cas9が侵入核酸を切断→ウイルス遺伝子を沈黙化"]

細菌ゲノムからCRISPR RNAの転写が起こる
トランス活性化RNAがpre-CRISPR RNA配列に相補的で塩基対合base pairing塩基対合（base pairing）base pairing（塩基対合）する→RNA二重鎖heavy chain重鎖（heavy chain）heavy chain（重鎖）を形成
RNA二重鎖heavy chain重鎖（heavy chain）heavy chain（重鎖）が切断されトランス活性化RNAとCRISPR RNAのハイブリッドhybridハイブリッド（hybrid）hybrid（ハイブリッド）を形成する
このハイブリッドhybridハイブリッド（hybrid）hybrid（ハイブリッド）がエンドヌクレアーゼendonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease）endonuclease（エンドヌクレアーゼ）Cas9のガイドとして機能し、侵入核酸を切断する→ウイルス遺伝子を沈黙化させる

まとめ

遺伝子治療は生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）（患者体内で直接導入）とex vivo（細胞を単離・培養・修正後に移植）の2方式に大別され、ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）（レトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス・アデノウイルスAdenovirusアデノウイルス（Adenovirus）Adenovirus（アデノウイルス）・AAV・HSV、それぞれ組み込み能・免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）・搭載サイズが異なる）と非ウイルスベクターNon-viral vectors非ウイルスベクター（Non-viral vectors）Non-viral vectors（非ウイルスベクター）（リポプレックスlipoplexリポプレックス（lipoplex）lipoplex（リポプレックス）、DNA分子複合体、人工染色体）を用いて遺伝子を送達する。
遺伝子付加gene augmentation遺伝子付加（gene augmentation）gene augmentation（遺伝子付加）は機能喪失疾患（特に常染色体劣性autosomal recessive常染色体劣性（autosomal recessive）autosomal recessive（常染色体劣性）疾患）に対し正常遺伝子産物を補充する最も一般的な遺伝子治療形式である。
CRISPR/Cas9は細菌の適応免疫adaptive適応免疫（adaptive）adaptive（適応免疫）機構（CRISPR座位へのウイルスDNAスペーサーspacerスペーサー（spacer）spacer（スペーサー）獲得）に由来し、crRNA-Cas9複合体が標的DNAを配列特異的に切断することでゲノム編集genome editingゲノム編集（genome editing）genome editing（ゲノム編集）を可能にする。