細胞生物学の手法：細胞培養、細胞分画、in vivo顕微鏡観察、フローサイトメトリー、FACS（EM学生のみ）

🧠 この単元は「細胞周期という制御ネットワークregulatory network制御ネットワーク（regulatory network）regulatory network（制御ネットワーク）を、4つの異なる窓から覗く」ための道具tool道具（tool）tool（道具）箱である——細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）は観察の舞台を用意し（in vitroで他の細胞との相互作用を排除する）、細胞分画cell fractionation細胞分画（cell fractionation）cell fractionation（細胞分画）は舞台の中身をオルガネラ単位に分解し、生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）顕微鏡は生きたまま色をつけて見る窓、フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）/FACFunctional Ambulation CategoryFAC（Functional Ambulation Category）Functional Ambulation Category（FAC）SはDNA量という1つの指標だけで何千もの細胞を瞬時に分類・分離する窓である。共通するのは「見えないものを、何らかの物理的性質physical nature物理的性質（physical nature）physical nature（物理的性質）（密度、蛍光、電荷）に変換して初めて見える/分けられるようにする」という発想である。

細胞制御ネットワークを理解する4つの手法

1. 細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）： 細胞周期を検証するには、細胞を培養状態で維持する必要がある
2. フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）： 細胞周期の各相phase各相（phase）phase（各相）における位置を推定できる
3. 顕微鏡観察microscopy顕微鏡観察（microscopy）microscopy（顕微鏡観察）： 細胞周期の各相phase各相（phase）phase（各相）から推定・検証できる
4. 細胞分画cell fractionation細胞分画（cell fractionation）cell fractionation（細胞分画）： 曝露した細胞の特定の構成要素を分離・単離する

1. 細胞培養

細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）とは、分散した（散在する）細胞をin vitro（試験管内）条件下で維持することを指す。in vitro（「ガラスの中で」の意）とは、生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）で起こる過程を実験室条件下で、外的影響を制御しながら操作することを意味する。

• 培養では、細胞は増殖に必要な栄養素・成長因子growth factor成長因子（growth factor）growth factor（成長因子）・気体を供給する適切な培養培地からなる人工的環境で維持される
• 培養は特定組織の分散した細胞から、あるいは組織形成を伴わない特定の細胞株cell line細胞株（cell line）cell line（細胞株）から作られうる
• 細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）の重要性： 細胞自身の性質を、他の細胞型との相互作用が起こらない状態で自由に調べることができる。培養中の細胞は独立した単位とみなされる→より大きな組織内での役割ではなく、個々の細胞に焦点を当てられる

細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）の利点： 異なる細胞型を互いに独立して育てられる、実験条件（pH、温度など）の制御が生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）よりin vitroの方が容易、観察が容易、操作可能かつ消耗wasting; depletion消耗（wasting; depletion）wasting; depletion（消耗）可能（遺伝子の挿入、分子の単離）、大量の細胞を長期間得て保存できる、多くの細胞機能を検証できる、細胞型を特定できる。

細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）の欠点： 結果を留保なしに扱うことはできない、形質転換された細胞は正常細胞に似なくなっていく（変異、代謝変化post-mortem metabolism代謝変化（post-mortem metabolism）post-mortem metabolism（代謝変化）、組織構造の欠如）。

細胞培養の種類

初代培養primary culture初代培養（primary culture）primary culture（初代培養）： 生物の組織から直接調製される培養。細胞は他の細胞型・ECMからも分離され、培養中に1つの細胞型のみが存在するようにする。初代培養primary culture初代培養（primary culture）primary culture（初代培養）からの継代passage継代（passage）passage（継代）を数回経ると寿命が尽きる（約40〜50継代passage継代（passage）passage（継代）/分裂）。初代培養primary culture初代培養（primary culture）primary culture（初代培養）の細胞は培養皿から取り出し、いわゆる二次培養として繰り返し再培養できる→数週間〜数か月にわたり反復継代passage継代（passage）passage（継代）できる。

細胞株cell line細胞株（cell line）cell line（細胞株）： 単一細胞から発展した培養であり、均一な遺伝的組成の細胞からなる（HeLa細胞＝子宮頸がん由来の不死化immortalization不死化（immortalization）immortalization（不死化）細胞株cell line細胞株（cell line）cell line（細胞株））。適切な条件下で遺伝的に均一なまま無期限に持続培養できる。正常細胞のin vitro形質転換（レトロretroレトロ（retro）retro（レトロ）ウイルス導入によるオンコジーンoncogeneオンコジーン（oncogene）oncogene（オンコジーン）導入）または腫瘍細胞（生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）で正常細胞のトランスフェクトされたバージョンとみなせる）を用いて得られる。細胞株cell line細胞株（cell line）cell line（細胞株）は維持が容易である：遺伝的に均一、凍結・保存が容易、企業や研究室から入手しやすい。

培養培地と培養の維持

培養培地： 細胞が適切に増殖し生命を維持できる栄養豊富な培地。主要成分：無機塩（緩衝系Buffers緩衝系（Buffers）Buffers（緩衝系））、微量元素element元素（element）element（元素）、炭水化物、アミノ酸、ビタミン、脂肪酸・脂質、タンパク質・ペプチド、血清、フェノールphenolフェノール（phenol）phenol（フェノール）レッド指示薬marker指示薬（marker）marker（指示薬）など。

培養維持の条件： 至適増殖温度optimal growth temperature至適増殖温度（optimal growth temperature）optimal growth temperature（至適増殖温度）（哺乳類mammal哺乳類（mammal）mammal（哺乳類）細胞株cell line細胞株（cell line）cell line（細胞株）では37度）、一定のCO2分圧、適切な湿度の確保、無菌条件（細胞の継代passage継代（passage）passage（継代）は無菌ボックス内で行う——細胞の微生物感染を避けることが重要であり、全ての段階を無菌条件下で行わなければならない）。

栄養豊富な環境における細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）の増殖は指数関数的exponentially指数関数的（exponentially）exponentially（指数関数的）であり、飽和に達するまで続く→増殖の余地がない、あるいは増殖を維持するのに十分な栄養がない状態を意味する。プラトーplateauプラトー（plateau）plateau（プラトー）期では周囲の状況変化により増殖が減速deceleration減速（deceleration）deceleration（減速）する＝実験を行うのに最も適した段階である。

長期間保存する場合は凍結すべきである。凍結は1分あたり1度の温度低下で均一に行うべきだが、解凍はできる限り速く行うべきである。

2. 細胞分画

細胞分画cell fractionation細胞分画（cell fractionation）cell fractionation（細胞分画）とは、各構成要素の個々の機能を保持したまま細胞内区画intracellular compartment細胞内区画（intracellular compartment）intracellular compartment（細胞内区画）を分離するために用いられる過程である。

• 細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）を分離し個別に研究できるようにする→細胞の「分画」を研究する
• 支配的な細胞集団が同一の細胞型からなる臓器（肝臓や筋肉など）から採取した試料の方が扱いやすい

細胞分画cell fractionation細胞分画（cell fractionation）cell fractionation（細胞分画）の手順は2つの主要な段階からなる：①均質化homogenization均質化（homogenization）homogenization（均質化）：細胞の破壊と展開により細胞分画cell fractionation細胞分画（cell fractionation）cell fractionation（細胞分画）を利用可能にする　②遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）：遠心centrifugation遠心（centrifugation）centrifugation（遠心）沈降により細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）を分離し分画を作る。

均質化

均質化homogenization均質化（homogenization）homogenization（均質化）の目的は、(1)臓器/組織由来の試料において、細胞をその組織結合tissue binding組織結合（tissue binding）tissue binding（組織結合）（細胞-細胞関係）から解放すること、(2)表面の分子的つながりを破壊し、細胞を探索できるようにすること——形質膜plasma membrane形質膜（plasma membrane）plasma membrane（形質膜）を破壊することで達成できる。

均質化homogenization均質化（homogenization）homogenization（均質化）の方法：

1. 浸透圧ショック： 低張液hypotonic fluid低張液（hypotonic fluid）hypotonic fluid（低張液）を用いることで、膜結合空間が水を取り込む→空間の膨張を引き起こし最終的に膜を破裂させる
2. ナイフホモジナイザーknife homogenizerナイフホモジナイザー（knife homogenizer）knife homogenizer（ナイフホモジナイザー）： 界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤）や有機溶媒（胆汁酸）と組み合わせて使用できる。高分子（例：DNA）の分離にも適している
3. 超音波： 細胞壁を破壊でき、細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）や懸濁液suspension懸濁液（suspension）suspension（懸濁液）の処理によく用いられる。圧力はせん断力shear forceせん断力（shear force）shear force（せん断力）によって生じる
4. フレンチプレスFrench pressフレンチプレス（French press）French press（フレンチプレス）： 高圧下で狭いバルブを通過させることにより細胞の形質膜plasma membrane形質膜（plasma membrane）plasma membrane（形質膜）を破壊する。細胞懸濁液suspension懸濁液（suspension）suspension（懸濁液）が特定の圧力で小さな隙間を通過し、細胞へのせん断応力shear stressせん断応力（shear stress）shear stress（せん断応力）と圧力変化が細胞膜の破壊を引き起こす

Potter-Elvehjem型ホモジナイザー： ガラス管とそれに精密に合うテフロン製プランジャーからなる。組織の小片を含む試料/細胞懸濁液suspension懸濁液（suspension）suspension（懸濁液）を管内に入れ、プランジャーを回転させながら挿入する→物質が数回押される。その結果、臓器断片が崩壊し、細胞が分離し、細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）が渦を巻く。

得られた分散液＝ホモジネートhomogenateホモジネート（homogenate）homogenate（ホモジネート）は、細胞断片・細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）・その他の細胞要素を含む分散系である。ホモジネートhomogenateホモジネート（homogenate）homogenate（ホモジネート）は濃すぎる（内部摩擦が大きい）ため、展開前に均質化homogenization均質化（homogenization）homogenization（均質化）培地を加える。この培地は細胞内条件を模倣する：陽イオンcation陽イオン（cation）cation（陽イオン）・陰イオンanion陰イオン（anion）anion（陰イオン）・緩衝成分・適切な浸透圧レベルを含む。

均質化homogenization均質化（homogenization）homogenization（均質化）は(1)穏やか：脆弱なオルガネラを保持できるが均一な展開が得られない、(2)強力：均一な展開が得られるがより繊細なオルガネラに大きな損傷を与える、のいずれかでありうる。

遠心分離

遠心centrifugation遠心（centrifugation）centrifugation（遠心）沈降により細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）を分離し分画を作る過程。ホモジネートhomogenateホモジネート（homogenate）homogenate（ホモジネート）内の異なる部分を、そのサイズと密度に基づいて遠心centrifugation遠心（centrifugation）centrifugation（遠心）沈降により分離する。

• ホモジネートhomogenateホモジネート（homogenate）homogenate（ホモジネート）は低温（0度近く）に保つべきである——分解酵素の活性を抑制するため。必要であれば酵素阻害enzyme inhibition酵素阻害（enzyme inhibition）enzyme inhibition（酵素阻害）剤を添加できる
• 試料を含む管は金属ローターの円筒形の穴のリングに挿入される。ローターの急速な回転が巨大な遠心centrifugation遠心（centrifugation）centrifugation（遠心）力を生み、試料中の粒子が試料管の底部側面に沈降する
• スベドベリSvedbergスベドベリ（Svedberg）Svedberg（スベドベリ）（S）単位は、ある細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）の沈降速度を特徴づける単位として用いられる。特定のサイズ・形状の粒子の沈降速度は、粒子が管の底に沈む速さを測定する
• S値が大きいほど粒子は大きく、遠心centrifugation遠心（centrifugation）centrifugation（遠心）機の底に速く到達する

分画遠心法differential centrifugation分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法）： ある細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）の既知のS値に基づき、濾液内のどこにその細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）が存在するかを予測できる。連続的な遠心分離centrifugation遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離）のラウンドにより、その細胞小器官organelles細胞小器官（organelles）organelles（細胞小器官）を単離できる。

3. 生体内顕微鏡観察

生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）顕微鏡観察microscopy顕微鏡観察（microscopy）microscopy（顕微鏡観察）は生細胞に対して行われ、非毒性で細胞生理と適合する特殊なマーカーを用いる。融合タンパク質fusion protein融合タンパク質（fusion protein）fusion protein（融合タンパク質）が内因性タンパク質を蛍光タンパク質で標識するために最もよく用いられる。これによりこれらのタンパク質の輸送、局在、相互作用をあらゆる種類の顕微鏡で追跡できる。

この技術により以下が可能になる：大部分の疾患の認識、治療法の精密な決定（検査＋確認）、病理検査（診断、手術、治癒）、細胞レベルCellular細胞レベル（Cellular）Cellular（細胞レベル）の生理・生物学的研究（薬物開発drug development薬物開発（drug development）drug development（薬物開発）＋試験）。

光学顕微鏡light microscopy, LM光学顕微鏡（light microscopy, LM）light microscopy, LM（光学顕微鏡）： 観察対象を照らし、光学レンズ系を通過させて拡大し、人の目が像を直接捉えられるようにする。しかし限界がある：①暗いか高反射性の表面しか見えない/検証できない　②回折のため解像度resolution解像度（resolution）resolution（解像度）が非常に限定される　③焦点面の外にある点が像の鮮明さを低下させる。

生細胞では、細胞の内部構造が無色透明であるため良好な可視性を得るのに十分なコントラストcontrastコントラスト（contrast）contrast（コントラスト）がない。したがって様々な色素などのコントラストcontrastコントラスト（contrast）contrast（コントラスト）剤がしばしば固定標本や死んだ標本に適用される。

蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）： 電磁放射electromagnetic radiation電磁放射（electromagnetic radiation）electromagnetic radiation（電磁放射）を吸収した物質による光の蛍光発光を利用する。ルミネセンスの一形態であり、放出される光は吸収された放射より波長が長くエネルギーが低い。

• 蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）の利用は、大部分の有機化合物organic compound有機化合物（organic compound）organic compound（有機化合物）・細胞構成要素・ビタミン・アミノ酸などがUVや可視光で照らされると、その化学構造に特徴的な可視光を放出するという事実に基づく
• 大部分の場合、検証すべき構成要素は蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）で標識される——それら自体がある程度光を放出する場合でも
• 蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）の像は染色された部分のみを示す——これにより異なる構造を異なる色で染めることができ、高い特異性の像を得られる→並行して検証できる 例：核ラミナnuclear lamina核ラミナ（nuclear lamina）nuclear lamina（核ラミナ）、微小管、DNAを異なる色で染色→細胞周期中の変化を観察できる

4. フローサイトメトリー

フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）は高速な多パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）検証のための実験室手法である。混合細胞集団を用いて、各細胞型をその表現型や機能状態functional status機能状態（functional status）functional status（機能状態）によって個別に測定・解析・分離できる。

• アパーチャーとの直接接触は細胞を損傷させ、正確な測定には細胞の正確な位置決めが重要であるため、通常シース液sheath fluidシース液（sheath fluid）sheath fluid（シース液）と呼ばれる別の流体系が用いられ、これが試料流体を取り囲んで同心円柱を形成する
• 両方の流体系とヘッド内の開口部は圧力調節されており、流れは層流laminar flow層流（laminar flow）laminar flow（層流）となる→これを流体力学的集束hydrodynamic focusing流体力学的集束（hydrodynamic focusing）hydrodynamic focusing（流体力学的集束）と呼ぶ
• 細胞は集束focusing集束（focusing）focusing（集束）した光源（レーザーまたはランプ）により照らされる。各細胞から光信号が生成される——一部は光散乱light scattering光散乱（light scattering）light scattering（光散乱）により、また蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）が標識されている場合は蛍光信号による。これらの光信号は適切な検出器で測定できる→蛍光マーカーを用いてフローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）を適用する場合、蛍光標識細胞分取fluorescence-activated cell sorting (FACS)蛍光標識細胞分取（fluorescence-activated cell sorting (FACS)）fluorescence-activated cell sorting (FACS)（蛍光標識細胞分取）として知られる

最もよく測定される細胞パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）の1つは細胞のDNA含量である→核酸特異的蛍光マーカー（例：ヨウ化プロピジウム＝PI）で追跡できる。これらの色素は透過性のある細胞の膜を容易に通過し高親和性high affinity高親和性（high affinity）high affinity（高親和性）でDNAに結合する。結合の結果、蛍光団の蛍光量子活性が大幅に増加する。染色された色素の蛍光強度はDNA含量に比例する。

大部分の核酸指示薬marker指示薬（marker）marker（指示薬）はRNAも示す。したがって精密測定の場合、測定はRNA消化と組み合わされるか、選択的なDNA-RNA標識を達成できるアクリジンオレンジ蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）が用いられる。この色素は二本鎖核酸に結合すると緑色蛍光を発し、一本鎖核酸に結合すると赤色蛍光を発する。

最もよく用いられる用途： プログラム細胞死（アポトーシス）のモニタリング——DNA含量を変化させるため。DNA分布は細胞周期の異なる相にある細胞の分画を特徴づけるために用いられうる。

FACS（蛍光標識細胞分取）

• フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）の特殊な型である
• 生物学的細胞の不均一な混合物を、細胞の特異的な光散乱light scattering光散乱（light scattering）light scattering（光散乱）・蛍光特性に基づき2つ以上の容器へ、1細胞ずつ分取する方法を提供する
• 個々の細胞からの蛍光信号の高速・客観的objective客観的（objective）objective（客観的）・定量的な記録、および関心のある細胞の物理的分離を提供する有用な科学機器である
• 細胞懸濁液suspension懸濁液（suspension）suspension（懸濁液）は狭く急速に流れる液流の中心に保たれる
• 流れは細胞間に大きな間隔ができるよう調整され、振動機構が細胞の流れを個々の液滴へ分解させる
• 流れが液滴に分解する直前に、蛍光測定ステーションstationステーション（station）station（ステーション）を通過し、そこで対象細胞の蛍光特性が測定される
• 電気帯電リングが流れが液滴に分解する地点に置かれる
• 帯電した液滴はその後静電偏向系を通過して落下し、その電荷に基づいて容器へ振り分けられる

flowchart TD
  A["細胞<span class='jp-term jp-term-diagram' title='suspension'>懸濁液</span>が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sheath fluid'>シース液</span>により流体力学的に<span class='jp-term jp-term-diagram' title='focusing'>集束</span>"] --> B["レーザー/ランプによる各細胞の照射"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='light scattering'>光散乱</span>・蛍光信号の測定"]
  C --> D["流れが振動により個々の液滴へ分解"]
  D --> E["液滴が電気的に帯電"]
  E --> F["静電偏向系により電荷に応じ容器へ分取"]

まとめ

• 細胞培養cell culture細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養）は初代培養primary culture初代培養（primary culture）primary culture（初代培養）（有限寿命）と細胞株cell line細胞株（cell line）cell line（細胞株）（無限増殖可能、遺伝的に均一）に分けられ、他の細胞との相互作用を排除した状態で個々の細胞の性質を調べることを可能にする。
• 細胞分画cell fractionation細胞分画（cell fractionation）cell fractionation（細胞分画）は均質化homogenization均質化（homogenization）homogenization（均質化）（浸透圧ショック、ナイフホモジナイザーknife homogenizerナイフホモジナイザー（knife homogenizer）knife homogenizer（ナイフホモジナイザー）、超音波、フレンチプレスFrench pressフレンチプレス（French press）French press（フレンチプレス）など）によりホモジネートhomogenateホモジネート（homogenate）homogenate（ホモジネート）を作り、分画遠心法differential centrifugation分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法）（スベドベリSvedbergスベドベリ（Svedberg）Svedberg（スベドベリ）単位に基づく沈降速度の違いを利用）によりオルガネラを分離・単離する。
• 生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）顕微鏡観察microscopy顕微鏡観察（microscopy）microscopy（顕微鏡観察）（蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）による生細胞の可視化）とフローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）/FACFunctional Ambulation CategoryFAC（Functional Ambulation Category）Functional Ambulation Category（FAC）S（DNA含量などの蛍光信号に基づく高速な多パラメータParameterパラメータ（Parameter）Parameter（パラメータ）測定・細胞分取）は、細胞周期の位置づけや細胞死の検出など、細胞制御ネットワークregulatory network制御ネットワーク（regulatory network）regulatory network（制御ネットワーク）を異なる角度から観察する相補的な手法である。