真核生物mRNAのプロセシング

🧠 pre-mRNAの成熟は「5′キャップ付加→3′切断/ポリアデニル化polyadenylation ポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化） →RNARNA（ribonucleic acid）スプライシング」という3つの共転写的 co-transcriptional 共転写的（co-transcriptional） co-transcriptional（共転写的） 修飾からなり、いずれも共通の目的——「核内で他のRNAから区別され、分解酵素から保護され、正しいコード領域だけが残る」——を果たす。スプライシングにおけるスプライソソーム spliceosome スプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム） （U1・U2・U4・U5・U6 snRNP）の組み立てとほどけの連鎖は、この一連の加工の中で最も精巧な分子機械であり、2回のトランスエステル化 esterification エステル化（esterification） esterification（エステル化） 反応でイントロンをラリアット lariat (RNA splicing intermediate) ラリアット（lariat (RNA splicing intermediate)） lariat (RNA splicing intermediate)（ラリアット） （投げ縄）として正確に切り出す。

概観

真核生物細胞は、RNAポリメラーゼIIにより合成された初期一次転写産物を、成熟し機能的なmRNAへ変換する（pre-mRNA→成熟mRNA）。

mRNA成熟の3大イベント：

これらの事象は共転写的co-transcriptional共転写的（co-transcriptional）co-transcriptional（共転写的）に進行する——5′キャップ付加はRNAポリメラーゼが転写を開始した直後に始まる。細胞質への輸送は、プロセシング終了後まもなく特異的なRNA輸送タンパク質 transport protein 輸送タンパク質（transport protein） transport protein（輸送タンパク質） の助けで開始される。

💡 この3つに加えて、塩基そのものの化学修飾 chemical modification 化学修飾（chemical modification） chemical modification（化学修飾） （エピトランスクリプト crypt クリプト（crypt） crypt（クリプト） ーム）が第4の加工として働く。 mRNA内部で最も高頻度な修飾はN6-メチルアデノシン（m6A）で、抗体濃縮＋次世代シーケンサによるm6A-seqでヒトの7,000を超える遺伝子の転写産物上に12,000以上の部位が同定されている。部位は終止コドンstop codon 終止コドン（stop codon）stop codon（終止コドン） 周辺と長い内部エキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） 内に集中し、ヒトとマウスで保存されている。メチル基転移酵素METTL3/METTL14 メチル基転移酵素（METTL3/METTL14）METTL3/METTL14（メチル基転移酵素） を抑えると遺伝子発現と選択的スプライシング alternative splicing 選択的スプライシング（alternative splicing） alternative splicing（選択的スプライシング） のパターンが変わることから、m6Aはキャップ・ポリA・スプライシングと並ぶ調節層とみなされる¹。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='exon'>エキソン</span>-イントロン-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='exon'>エキソン</span>、poly(A)部位、終結部位"] --> B["1. 転写、5'キャップ付加"]
  B --> C["2. poly(A)部位での<span class='jp-term jp-term-diagram' title='endonuclease'>エンドヌクレアーゼ</span>切断"]
  C --> D["3. ポリA重合酵素（PAP）による<span class='jp-term jp-term-diagram' title='polyadenylation'>ポリアデニル化</span>"]
  D --> E["4. <span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>スプライシング"]
  E --> F["成熟mRNA"]

① 5′キャップ付加

RNA鎖が約25ヌクレオチドの長さに達すると、7-メチルグアノシン guanosineグアノシン（guanosine） guanosine（グアノシン）（および最初の2つのリボース ribose リボース（ribose） ribose（リボース） のメチル化）からなる保護キャップが、5′-5′三リン酸架橋により最初のヌクレオチドの5′端に付加される。

キャップは酵素グアニリル転移酵素guanylyl transferaseグアニリル転移酵素（guanylyl transferase）guanylyl transferase（グアニリル転移酵素）により付加され、これはまずRNAポリメラーゼと相互作用しうる。RNAポリメラーゼへの結合と、5′-リン酸化されたCTD（C末端ドメイン）によるキャッピング capping (mRNA 5′ cap addition) キャッピング（capping (mRNA 5′ cap addition)） capping (mRNA 5′ cap addition)（キャッピング） 酵素の活性化により、以下の特徴的な事象の連鎖が起こる：

1. RNA三リン酸ホスファターゼ（3つのキャッピング capping (mRNA 5′ cap addition) キャッピング（capping (mRNA 5′ cap addition)） capping (mRNA 5′ cap addition)（キャッピング） 酵素の1つ）が5′端からγ-リン酸を除去する——残るα・βリン酸はキャップに付随したまま残る
2. グアニリル転移酵素guanylyl transferaseグアニリル転移酵素（guanylyl transferase）guanylyl transferase（グアニリル転移酵素）がGTPからGMP部分を伸長中の転写産物の5′-二リン酸へ転移し、グアノシンguanosine グアノシン（guanosine）guanosine（グアノシン） -5′-5′-三リン酸架橋を作る
3. 最終段階で、様々な種類のメチル転移酵素methyltransferaseメチル転移酵素（methyltransferase）methyltransferase（メチル転移酵素）がS-アデノシルメチオニン S-adenosylmethionine S-アデノシルメチオニン（S-adenosylmethionine） S-adenosylmethionine（S-アデノシルメチオニン） からメチル基 methyl group メチル基（methyl group） methyl group（メチル基） （CH₃）を①グアニン guanine グアニン（guanine） guanine（グアニン） のN7位②最初の1〜2ヌクレオチドの2′酸素へ転移する→この過程がRNAポリメラーゼIIをより速い伸長モードへ移行させる

⭐ この機構の正味の効果（新生鎖の保護に加えて）は、ポリメラーゼが成長中のRNAがキャップされるまで待ってから急速な速度で伸長を始めることである。

② 3′切断とポリアデニル化

ポリアデニル化polyadenylation ポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化） とは、約250個のアデノシン残基からなるポリA尾部の付加であり、分解酵素からRNA鎖を保護する重要な役割を持つと考えられている。この過程では、特異的なタンパク質-核酸相互作用とタンパク質-タンパク質相互作用のネットワークを通じて多タンパク質複合体が組み立てられる。

機序：

1. pre-mRNA中の特異的配列シグナルがタンパク質因子のpre-mRNAへの結合を指示する——保存されたAAUAAA配列が必須であり、下流のG/Uに富む配列も重要
2. 切断＋ポリアデニル化特異性因子 cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF)ポリアデニル化特異性因子（cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF)） cleavage and polyadenylation specificity factor (CPSF)（ポリアデニル化特異性因子）が上流のAAUAAAポリアデニル化シグナル polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル（polyadenylation signal） polyadenylation signal（ポリアデニル化シグナル） に結合する
3. 切断刺激因子CstF (cleavage stimulation factor)切断刺激因子（CstF (cleavage stimulation factor)）CstF (cleavage stimulation factor)（切断刺激因子）が下流のGUまたはUに富む配列と結合したCPSFに相互作用し、RNA中にループを形成する
4. 切断因子（CFI＋CFII）の結合が複合体を安定化する
5. ポリアデニル酸重合酵素poly(A) polymeraseポリアデニル酸重合酵素（poly(A) polymerase）poly(A) polymerase（ポリアデニル酸重合酵素）の結合が、上流ポリアデニル化シグナル polyadenylation signal ポリアデニル化シグナル（polyadenylation signal） polyadenylation signal（ポリアデニル化シグナル） の3′側15〜30ヌクレオチドに通常位置するポリA切断部位での切断を刺激する
6. 切断因子群、および下流のRNA切断産物 cleavage product 切断産物（cleavage product） cleavage product（切断産物） （急速に分解される）が放出される
7. 結合したPAPは切断反応で生じた3′-OH基へ、緩やかな速度で約12個のA残基を付加する
8. ポリアデニル酸結合タンパク質poly(A)-binding protein (PABP)ポリアデニル酸結合タンパク質（poly(A)-binding protein (PABP)）poly(A)-binding protein (PABP)（ポリアデニル酸結合タンパク質）が初期の短いポリA尾部に結合し、アデニル化を加速する
9. 200〜250個のA残基が付加された後、PABがPAPに停止を指示する

③ RNAスプライシング

成熟し機能的なmRNAの形成過程で、イントロンが除去されエキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） が繋ぎ合わされる。スプライシングの過程は2回のトランスエステル化機構trans-esterification mechanismトランスエステル化機構（trans-esterification mechanism）trans-esterification mechanism（トランスエステル化機構）を伴い、1つのエステル結合 ester bond エステル結合（ester bond） ester bond（エステル結合） が切断され新たな結合に置き換えられ、隣接する2つのエキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） が連結される。

スプライシングにはpre-mRNAと塩基対合 base pairing 塩基対合（base pairing） base pairing（塩基対合） してスプライソソームspliceosomeスプライソソーム（spliceosome）spliceosome（スプライソソーム）を形成する低分子核内RNA（snRNA）の存在が必要である。

特異的snRNP配列：

• U1： 5′スプライス部位 splice site スプライス部位（splice site） splice site（スプライス部位） 結合
• U2： ブランチポイント結合（イントロン内のA地点）
• U5： 3′スプライス部位 splice site スプライス部位（splice site） splice site（スプライス部位） 結合
• U4・U6： 複合体組み立てと触媒活性 catalytic activity触媒活性（catalytic activity） catalytic activity（触媒活性）

これらが集まりスプライソソームspliceosomeスプライソソーム（spliceosome）spliceosome（スプライソソーム）と呼ばれる大きなリボヌクレオタンパク質複合体 nucleoprotein complex ヌクレオタンパク質複合体（nucleoprotein complex） nucleoprotein complex（ヌクレオタンパク質複合体） を形成する。

💡 U5の役割は「3′側に結合する」だけではない。 3′スプライス部位 splice site スプライス部位（splice site） splice site（スプライス部位） そのものの認識はU2AF（ポリピリミジン管polypyrimidine tract ポリピリミジン管（polypyrimidine tract）polypyrimidine tract（ポリピリミジン管） と末端AGへの結合）が担い、U5 snRNPは5′エキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） と3′エキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） の両方の末端配列を掴んで2つのエキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） を触媒中心 catalytic center 触媒中心（catalytic center） catalytic center（触媒中心） で並べる役割を持つ。第2トランスエステル化 esterification エステル化（esterification） esterification（エステル化） で正しいエキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） 同士が繋がるのは、U5がこの「位置合わせ」を行っているためである。またU4はU6の触媒配列を覆って不活性に保つシャペロン chaperone シャペロン（chaperone） chaperone（シャペロン） 役で、活性化の際に解離する（後述の機序4）——U4自身が触媒活性 catalytic activity 触媒活性（catalytic activity） catalytic activity（触媒活性） を持つわけではない。

💡 上記は主要（U2型）スプライソソーム spliceosome スプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム） の話であり、少数派の系統がもう1つある。 ヒトを含む複数種のスプライス部位 splice site スプライス部位（splice site） splice site（スプライス部位） を網羅的に分類すると、U2型（GT-AG・GC-AG）のほかにU12型（GT-AG型とAT-AC型）という稀なカテゴリーが存在し、これらはU11・U12・U4atac・U6atacからなるマイナースプライソソーム spliceosomeスプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム）によって切り出される²。

機序：

flowchart TD
  A["U1が5'<span class='jp-term jp-term-diagram' title='splice site'>スプライス部位</span>と<span class='jp-term jp-term-diagram' title='base pairing'>塩基対合</span>"] --> B["SF1（スプライシング因子1）がブランチポイントAに結合"]
  B --> C["U2AF（U2会合因子）が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='polypyrimidine tract'>ポリピリミジン管</span>と3'<span class='jp-term jp-term-diagram' title='splice site'>スプライス部位</span>に会合"]
  C --> D["U2 snRNPがブランチポイントAに<span class='jp-term jp-term-diagram' title='base pairing'>塩基対合</span>結合しSF1を置換"]
  D --> E["U4・U5・U6のsnRNP複合体が初期複合体に参加→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='spliceosome'>スプライソソーム</span>形成"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='base pairing'>塩基対合</span>の再配置により<span class='jp-term jp-term-diagram' title='spliceosome'>スプライソソーム</span>が活性<span class='jp-term jp-term-diagram' title='conformation'>コンフォメーション</span>へ→U1・U4snRNP解離"]
  F --> G["第1トランス<span class='jp-term jp-term-diagram' title='esterification'>エステル化</span>反応（触媒コア：U6+U2）→2',5'-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='phosphodiester bond'>ホスホジエステル結合</span>の中間体形成"]
  G --> H["第2トランス<span class='jp-term jp-term-diagram' title='esterification'>エステル化</span>反応→2<span class='jp-term jp-term-diagram' title='exon'>エキソン</span>が3',5'-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='phosphodiester bond'>ホスホジエステル結合</span>で連結"]
  H --> I["イントロンが<span class='jp-term jp-term-diagram' title='lariat (RNA splicing intermediate)'>ラリアット</span>（投げ縄）構造として残存snRNAとともに放出"]

1. U1が5′スプライス部位 splice site スプライス部位（splice site） splice site（スプライス部位） と塩基対合 base pairing 塩基対合（base pairing） base pairing（塩基対合） した後、SF1（スプライシング因子1）がブランチポイントA（branch-point-A）に結合する。U2AF（U2会合因子）がポリピリミジン管 polypyrimidine tract ポリピリミジン管（polypyrimidine tract） polypyrimidine tract（ポリピリミジン管） と3′スプライス部位 splice site スプライス部位（splice site） splice site（スプライス部位） に会合する
2. U2 snRNPが塩基対合 base pairing 塩基対合（base pairing） base pairing（塩基対合） 相互作用を介してブランチポイントAに会合し、SF1を置換する
3. U4・U5・U6からなるsnRNP複合体が初期複合体に加わるとスプライソソーム spliceosome スプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム） が形成される
4. 塩基対合base pairing 塩基対合（base pairing）base pairing（塩基対合） 相互作用の再配置がスプライソソーム spliceosome スプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム） を活性コンフォメーション conformation コンフォメーション（conformation） conformation（コンフォメーション） へ変換し、U1・U4 snRNPを放出する
5. 第1トランスエステル化 esterification エステル化（esterification） esterification（エステル化） 反応は触媒コア（U6＋U2）により触媒され、2′,5′-ホスホジエステル結合 phosphodiester bondホスホジエステル結合（phosphodiester bond） phosphodiester bond（ホスホジエステル結合）を含む中間体を形成する
6. 第2トランスエステル化 esterification エステル化（esterification） esterification（エステル化） 反応が2つのエキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） を3′,5′-ホスホジエステル結合 phosphodiester bondホスホジエステル結合（phosphodiester bond） phosphodiester bond（ホスホジエステル結合）で連結し、イントロンをラリアットlariat (RNA splicing intermediate) ラリアット（lariat (RNA splicing intermediate)）lariat (RNA splicing intermediate)（ラリアット） （投げ縄、lariat）構造（短い尾を持つ環状分子）として、残りのsnRNAとともに放出する

⭐ 切り出されたラリアット lariat (RNA splicing intermediate) ラリアット（lariat (RNA splicing intermediate)） lariat (RNA splicing intermediate)（ラリアット） イントロンは脱分枝酵素 debranching enzyme 脱分枝酵素（debranching enzyme） debranching enzyme（脱分枝酵素） により線状RNAへ変換される——分解されるか、マイクロRNAmicroRNAマイクロRNA（microRNA）microRNA（マイクロRNA）の合成に利用されうる。

まとめ

• pre-mRNAの成熟は5′キャップ付加（7-メチルグアノシン guanosineグアノシン（guanosine） guanosine（グアノシン）、分解からの保護＋翻訳促進）・3′切断/ポリアデニル化polyadenylation ポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化） （CPSF/CStF/PAPによる約250Aのポリ A尾部付加）・RNAスプライシング（イントロン除去）という3つの共転写的 co-transcriptional 共転写的（co-transcriptional） co-transcriptional（共転写的） 事象からなる。
• 5′キャップはRNA三リン酸ホスファターゼ→グアニリル転移酵素 guanylyl transferase グアニリル転移酵素（guanylyl transferase） guanylyl transferase（グアニリル転移酵素） →メチル転移酵素 methyltransferase メチル転移酵素（methyltransferase） methyltransferase（メチル転移酵素） という3段階の酵素反応で形成され、ポリメラーゼの伸長速度を加速させる。
• 3′端はAAUAAA配列を目印にCPSF・CStFが複合体を形成して切断部位を決定し、PAPが約250個のアデニン adenine アデニン（adenine） adenine（アデニン） 残基を付加してmRNAを安定化する。
• RNAスプライシングはU1・U2・U4・U5・U6 snRNPが順次組み立てられるスプライソソーム spliceosome スプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム） （主要／U2型）によって触媒され、2回のトランスエステル化 esterification エステル化（esterification） esterification（エステル化） 反応でイントロンをラリアット lariat (RNA splicing intermediate) ラリアット（lariat (RNA splicing intermediate)） lariat (RNA splicing intermediate)（ラリアット） 構造として切り出し、エキソンexon エキソン（exon）exon（エキソン） 同士を連結する。少数派のU12型イントロンはU11・U12・U4atac・U6atacからなるマイナースプライソソーム spliceosome スプライソソーム（spliceosome） spliceosome（スプライソソーム） が担当する。
• キャップ・ポリA・スプライシングに加え、m6Aに代表される塩基修飾 modification of bases 塩基修飾（modification of bases） modification of bases（塩基修飾） （エピトランスクリプト crypt クリプト（crypt） crypt（クリプト） ーム）がmRNAの運命を決める第4の加工層として働く。