PCRおよびリアルタイムPCRの機能と応用

🧠 PCR（ポリメラーゼ連鎖反応polymerase chain reaction, PCRポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR）polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）、polymerase chain reaction）は「変性→アニーリング annealing アニーリング（annealing） annealing（アニーリング） →伸長」という3段階の温度サイクルを指数関数的 exponentially 指数関数的（exponentially） exponentially（指数関数的） に繰り返すだけの単純な原理でありながら、DNADNA（deoxyribonucleic acid）を2ⁿ倍（40サイクルなら2⁴⁰倍）に増幅する。旧来のPCRが増幅産物を「反応が終わった後」に電気泳動で見るのに対し、リアルタイムPCRreal-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR） は蛍光シグナルを「反応の最中」に追跡する——この「後で見る」から「今見る」への転換が、定性的検出から定量的解析への飛躍を可能にした。

PCR（ポリメラーゼ連鎖反応）とは

PCRは分子生物学で用いられる技術で、DNAの1コピーまたは少数コピーのセグメントを数桁にわたり増幅し、特定のDNA配列の数千〜数百万コピーを生成する。これにより電気泳動（可視化用）または即座のリアルタイムPCR real-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR） real-time PCR（リアルタイムPCR） によって特定の遺伝子を検出できるようになる。

大部分のPCR法は熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）に依存する——反応混合物 reaction mixture 反応混合物（reaction mixture） reaction mixture（反応混合物） を反復的な加熱・冷却サイクルに曝すことで、異なる温度依存性 biological temperature dependence 温度依存性（biological temperature dependence） biological temperature dependence（温度依存性） 反応を可能にする。

標的領域に相補的な配列を含むプライマーとDNAポリメラーゼ（この方法の名前の由来）が選択性と反復増幅を可能にする。PCRが進行するにつれ、生成されたDNA自体が複製の鋳型として使われ、連鎖反応が始動し、元のDNA鋳型が指数関数的 exponentially 指数関数的（exponentially） exponentially（指数関数的） に増幅される。つまり各サイクルで、存在する全てのDNA分子が半保存的複製 semiconservative replication 半保存的複製（semiconservative replication） semiconservative replication（半保存的複製） （05-principles-of-the-semiconservative-dna-replication-replication-fork-leading-and参照）を行う。

ほぼ全てのPCRは熱安定性DNAポリメラーゼ——Taqポリメラーゼ（好熱性thermophilic 好熱性（thermophilic）thermophilic（好熱性） 細菌から最初に単離された酵素）を用いる。このDNAポリメラーゼは一本鎖DNA single-stranded DNA 一本鎖DNA（single-stranded DNA） single-stranded DNA（一本鎖DNA） を鋳型とし、プライマーによりDNA合成を開始させ、遊離ヌクレオチドから新しいDNA鎖を酵素的に組み立てる。

前述の通り、DNAポリメラーゼは新規鎖の合成を開始できない（既存鎖の伸長のみ継続可能）ため、複製したい鋳型を指し示すためにプライマー分子を用いる。PCRで用いられるプライマーは人工の一本鎖DNA single-stranded DNA 一本鎖DNA（single-stranded DNA） single-stranded DNA（一本鎖DNA） である（細胞内の複製で使われる天然のプライマーはプライマーゼ primase プライマーゼ（primase） primase（プライマーゼ） が作る一本鎖RNA single-stranded RNA 一本鎖RNA（single-stranded RNA） single-stranded RNA（一本鎖RNA） で、そこが違う）。プライマーはゲノム中の相補領域に結合する——これによりどの領域を増幅したいかを選択する。

PCR手順（熱サイクル）

PCRの熱サイクル thermal cycling 熱サイクル（thermal cycling） thermal cycling（熱サイクル） は3つの段階に分けられる：

flowchart TD
  A["1. 変性（denaturation、94〜96℃、約45秒）"] --> B["水素結合が切断→鋳型となる<span class='jp-term jp-term-diagram' title='single-stranded DNA'>一本鎖DNA</span>"]
  B --> C["2. <span class='jp-term jp-term-diagram' title='annealing'>アニーリング</span>（annealing、50〜65℃、30〜60秒）"]
  C --> D["フォワード・リバース2種のプライマーが各ssDNA鋳型の3'側に結合"]
  D --> E["3. 伸長（elongation、約72℃、Taqポリメラーゼの至適温度）"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>ポリメラーゼが5'→3'方向へ遊離ヌクレオチドを付加し新鎖合成"]
  F --> A

1. 変性（95℃）

二本鎖DNAdouble-stranded DNA 二本鎖DNA（double-stranded DNA）double-stranded DNA（二本鎖DNA） が95℃（45秒）で熱変性する——相補塩基間の水素結合が切断され、DNAの一本鎖鋳型が得られる。

2. アニーリング（55℃前後）

反応温度が50〜72℃（30〜60秒）まで下げられ、プライマーが各ssDNA鋳型へアニーリング annealing アニーリング（annealing） annealing（アニーリング） できるようになる。2種のプライマー（それぞれ標的反応混合物 reaction mixture 反応混合物（reaction mixture） reaction mixture（反応混合物） を含む2つのssDNA相補鎖に対応、フォワード＋リバース）が必要である。プライマーは各鎖の3′端に結合する短い一本鎖配列で、増幅されるべき領域の境界を示す（DNAポリメラーゼの開始点）。プライマーの鎖へのハイブリダイゼーション hybridization ハイブリダイゼーション（hybridization） hybridization（ハイブリダイゼーション） を可能にする——塩基間の安定なH結合を達成する——ために十分低い温度であることが重要である。

3. 伸長（72℃）

プライマーの伸長は72℃で起こる（熱安定性Taqポリメラーゼの至適温度に対応）。DNAポリメラーゼによるDNA増幅：反応混合物 reaction mixture 反応混合物（reaction mixture） reaction mixture（反応混合物） 中の遊離ヌクレオチドを（5′→3′方向に）付加することで、DNA鋳型鎖に相補的な新しいDNA鎖を合成する。増幅産物の量はプライマー・ヌクレオチド・DNAポリメラーゼの寿命によって決まる。

各サイクル後、DNA配列は倍加する。コピー数copy number コピー数（copy number）copy number（コピー数） の計算式は2ⁿ（nはサイクル数）。通常この熱サイクル thermal cycling 熱サイクル（thermal cycling） thermal cycling（熱サイクル） は約40回（40サイクル）繰り返されるため、2⁴⁰個のコピーが得られる。

⭐ PCR第2サイクル（およびそれ以降）でDNA合成が行われる際、元の鋳型鎖上のプライマー位置で止まらない。 元の長い鋳型鎖の数は直線的に増加する（各サイクルで2本の新しい元の長鎖が生じる）が、新規合成鎖の数は指数関数的 exponentially 指数関数的（exponentially） exponentially（指数関数的） に増加する。

反応混合物

応用

• 遺伝子変異/多型の調査→候補遺伝子 candidate gene 候補遺伝子（candidate gene） candidate gene（候補遺伝子） （リスク因子）の同定、遺伝性疾患の診断（単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）または複合疾患 complex disease複合疾患（complex disease） complex disease（複合疾患））
• 「外来」ゲノムの同定：細菌・ウイルス→感染症の診断
• 犯罪学：親子鑑定 paternity test親子鑑定（paternity test） paternity test（親子鑑定）、遺伝子指紋 fingerprints 指紋（fingerprints） fingerprints（指紋） （犯人の同定）
• 遺伝子調節の調査→遺伝子発現解析 gene expression analysis遺伝子発現解析（gene expression analysis） gene expression analysis（遺伝子発現解析）、（m）RNARNA（ribonucleic acid）の定量的決定
• 遺伝子の機能/調節の解析、組換えタンパクrecombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein）recombinant protein（組換えタンパク） 質の産生→医薬品（発現ベクターexpression vector発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター）・レポーターベクター、19-generation-and-application-of-recombinant-dna-reporter-and-expression-vectors参照）

💡 PCRの外側には「増幅せずに検出する」「温度を振らずに増幅する」系列が育っている。 ①デジタルPCR（dPCR/ddPCR）——反応液をナノリットルの液滴数万個に分割し、各液滴の陽性/陰性をポアソン分布で数えることで、検量線calibration curve 検量線（calibration curve）calibration curve（検量線） なしに絶対コピー数 copy numberコピー数（copy number） copy number（コピー数）を出す。リアルタイムPCRreal-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR） と感度は同等だが精度が高く（変動係数coefficient of variation 変動係数（coefficient of variation）coefficient of variation（変動係数） が37〜86%低下）、日差再現性は約7倍良い¹。わずかな割合差の測定と稀少バリアント（血中循環腫瘍DNAなど）の定量に向き、阻害物質の影響も受けにくい²。②CRISPRベース検出——Cas13aやCas12aは標的を認識すると周囲の核酸を無差別に切る「コラテラル活性」を示すため、蛍光レポーターと組み合わせると標的の有無が光として読める。等温増幅と繋いだSHERLOCKはアトモル濃度の感度と1塩基ミスマッチ mismatch (base-pair mismatch) ミスマッチ（mismatch (base-pair mismatch)） mismatch (base-pair mismatch)（ミスマッチ） の識別能を持ち、試薬を凍結乾燥 lyophilization 凍結乾燥（lyophilization） lyophilization（凍結乾燥） して紙上で再構成できるためコールドチェーン不要の現場検査に使える³。

ゲル電気泳動

電気泳動は荷電 charged 荷電（charged） charged（荷電） 高分子（RNA、DNA、タンパク質、炭水化物）をその物理的性質 physical nature 物理的性質（physical nature） physical nature（物理的性質） に応じて分離する技術である。分離は溶液中の荷電 charged 荷電（charged） charged（荷電） 成分が電場 electric field 電場（electric field） electric field（電場） の作用下で異なる速度で移動するという事実に基づく。サイズによる分離：

• 小さな分子→抵抗が小さい→移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） が大きい→移動距離 excursion (distance of movement) 移動距離（excursion (distance of movement)） excursion (distance of movement)（移動距離） が長い（速い）
• 大きな分子→抵抗が大きい→移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） が小さい→移動距離 excursion (distance of movement) 移動距離（excursion (distance of movement)） excursion (distance of movement)（移動距離） が短い（遅い）

→ ゲルの孔径 pore size 孔径（pore size） pore size（孔径） が分子の移動速度を決定する。

インターカレーター色素intercalator dye インターカレーター色素（intercalator dye）intercalator dye（インターカレーター色素） はUV光を用いて蛍光を発生させ、ゲル内のDNAを可視化できるようにする。DNAは（リン酸基phosphate group リン酸基（phosphate group）phosphate group（リン酸基） のため）負電荷を帯びており、正極へ移動する。

リアルタイムPCR

• 従来型conventional 従来型（conventional）conventional（従来型） PCRでは、増幅されたDNA産物（アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）、amplicon）はエンドポイント解析で検出される
• 対照的に、リアルタイムPCRreal-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR） では増幅産物の蓄積が反応進行と同時に測定される——リアルタイムで、つまりPCR中に結果が得られる（後ではなく）

PCR産物のリアルタイム検出は、各反応に含まれる蛍光レポーター分子によって可能となり、産物DNA量の増加とともに蛍光が増加する。蛍光検出fluorescence detection 蛍光検出（fluorescence detection）fluorescence detection（蛍光検出） モジュールを備えた特殊なサーマルサイクラーが、増幅が進行する際の蛍光シグナルをモニタリングする。測定された蛍光は増幅されたDNA産物（アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン））の総量に比例し、経時的serial 経時的（serial）serial（経時的） な蛍光変化から各サイクルで産生されたアンプリコン amplicon アンプリコン（amplicon） amplicon（アンプリコン） 量が算出される。

リアルタイムPCRreal-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR） により鋳型DNAを相対的・絶対的absolute 絶対的（absolute）absolute（絶対的） の両方で決定できる：

⚠️ 「相対＝定性的」ではない。 相対定量は「どちらが多いか」を見るだけの定性法と誤解されやすいが、2^(-ΔΔCt)法は「対照の何倍」という数値を返す立派な定量法である。絶対定量と相対定量の違いは定量か定性かではなく、基準を外部の検量線 calibration curve 検量線（calibration curve） calibration curve（検量線） に置くか（絶対）、比較対象の試料と内部標準遺伝子に置くか（相対）の違いである⁴。

応用： 遺伝子発現解析gene expression analysis遺伝子発現解析（gene expression analysis）gene expression analysis（遺伝子発現解析）、「遺伝子量gene dosage遺伝子量（gene dosage）gene dosage（遺伝子量）」・CNV（コピー数変異copy number variation, CNVコピー数変異（copy number variation, CNV）copy number variation, CNV（コピー数変異））解析（大規模genome mutation 大規模（genome mutation）genome mutation（大規模） 反復変異）、SNPジェノタイピング genotypingジェノタイピング（genotyping） genotyping（ジェノタイピング）、新規多型の同定（「融解曲線解析、melting curve analysis」）。

まとめ

• PCRは変性（95℃、H結合切断）→アニーリング annealing アニーリング（annealing） annealing（アニーリング） （55℃前後、プライマー結合）→伸長（72℃、Taqポリメラーゼによる新鎖合成）という3段階の熱サイクル thermal cycling 熱サイクル（thermal cycling） thermal cycling（熱サイクル） をn回繰り返し、DNAを2ⁿ倍に指数関数的 exponentially 指数関数的（exponentially） exponentially（指数関数的） に増幅する。
• 新規合成鎖は指数関数的 exponentially 指数関数的（exponentially） exponentially（指数関数的） に増加する一方、元の長い鋳型鎖は直線的にしか増加しないという非対称性が、PCR産物の大部分を「望む長さの断片」に収束させる。
• ゲル電気泳動gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動） はDNAをサイズ（負電荷・孔径pore size 孔径（pore size）pore size（孔径） による移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） の違い）で分離する検出手段であり、遺伝子変異・多型の同定、感染症診断、法医学forensic medicine法医学（forensic medicine）forensic medicine（法医学）、遺伝子発現解析gene expression analysis 遺伝子発現解析（gene expression analysis）gene expression analysis（遺伝子発現解析） など幅広く応用される。
• リアルタイムPCRreal-time PCR リアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR） は蛍光レポーターにより増幅を反応進行中に定量し、相対的（2^(-ΔΔCt)法で変化倍率を出す）・絶対的absolute 絶対的（absolute）absolute（絶対的） （検量線calibration curve 検量線（calibration curve）calibration curve（検量線） でコピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） を出す）の両様式——どちらも定量法である——で遺伝子発現解析 gene expression analysis 遺伝子発現解析（gene expression analysis） gene expression analysis（遺伝子発現解析） やCNV解析 copy number variation analysisCNV解析（copy number variation analysis） copy number variation analysis（CNV解析）、SNPジェノタイピング genotyping ジェノタイピング（genotyping） genotyping（ジェノタイピング） に用いられる。
• 現在はこの外側に、検量線calibration curve 検量線（calibration curve）calibration curve（検量線） なしで絶対コピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） を数えるデジタルPCRと、等温増幅＋Cas13a/Cas12aのコラテラル活性で標的を光として読むCRISPRベース検出が加わっている。