遺伝子変異と多型の検査法（RFLP、アレル特異的PCR、DNAシークエンシング、プライマー伸長法）

🧠 点変異・SNPの検出における中心課題は「長さが同じ2つのアレルを、どうやって見分けられる別々のPCRPCR（polymerase chain reaction）産物に変換するか」である。 RFLPは制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） の認識部位そのものを壊す/保つという性質を利用し、アレル特異的PCRallele-specific PCR アレル特異的PCR（allele-specific PCR）allele-specific PCR（アレル特異的PCR） はプライマー3′末端が完全に相補的かどうか（校正proofreading 校正（proofreading）proofreading（校正） 活性を持たないポリメラーゼを使うので、3′末端のミスマッチ mismatch (base-pair mismatch) ミスマッチ（mismatch (base-pair mismatch)） mismatch (base-pair mismatch)（ミスマッチ） は修正されず伸長も起こらない）を利用する——手法は違えど、いずれも「配列の違いを長さ/有無の違いへ変換する」という同じ発想を実装している。

背景：長さ多型と点変異の違い

異なるアレルが異なる長さのPCR産物を生成するなら、患者にどちらのアレル（罹患型・健常型）が存在するかを判別できる。

• 長さ多型： 様々なアレルが単に長さだけ異なる
• 点変異/SNP： 様々なアレルの長さは同一——では、異なるアレルをどうやって異なるサイズのPCR産物へ変換するか？→複数の方法が存在する（PCR産物のサイズ・組成・化学的性質等を変化させる）

RFLP

RFLPは相同DNADNA（deoxyribonucleic acid）配列の変異を利用する技術である。RFLP解析では、DNA試料を断片化 fragmentation 断片化（fragmentation） fragmentation（断片化） し制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） で消化し、生じた制限断片をゲル電気泳動 gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis） gel electrophoresis（ゲル電気泳動） によりその長さに応じて分離する。これは遺伝性疾患の遺伝子座の局在化や疾患リスクの判定に応用できる。RFLPは個体の遺伝子型の決定にも使用できる。

• RFLPは基本的に制限エンドヌクレアーゼ endonuclease エンドヌクレアーゼ（endonuclease） endonuclease（エンドヌクレアーゼ） （天然の細菌酵素で、特異的認識部位でDNAを結合・切断する酵素）の利用に基づく——2つのアレルを区別する
• 制限エンドヌクレアーゼ endonuclease エンドヌクレアーゼ（endonuclease） endonuclease（エンドヌクレアーゼ） はDNA二重らせん double helix 二重らせん（double helix） double helix（二重らせん） 中の4〜8 bp長の回文配列 palindromic sequence 回文配列（palindromic sequence） palindromic sequence（回文配列） を認識し、ホスホジエステル結合phosphodiester bond ホスホジエステル結合（phosphodiester bond）phosphodiester bond（ホスホジエステル結合） の加水分解により両鎖を切断する
  • 粘着末端sticky end 粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端） ＝長さの異なる切断
  • 平滑末端blunt end 平滑末端（blunt end）blunt end（平滑末端） ＝同じ長さの切断
• SNVを含まない配列は認識部位を生成する→断片が切断される（図中のTアレル）
• SNVを含む配列は認識部位を破壊する→断片が切断されない（Cアレル）

→ どちらのアレルが切断され、どちらが切断されないかを認識した後、ゲル電気泳動gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動） により両者を容易に分離できる。

手順： 第1段階：領域を増幅→第2段階：RFLP（制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） 消化）→第3段階：ゲル電気泳動 gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis） gel electrophoresis（ゲル電気泳動）

アレル特異的PCR

アレル特異的プライマーに基づく技術で、SNPを効果的に解析するために使用できる。

2つの別々の反応混合物 reaction mixture 反応混合物（reaction mixture） reaction mixture（反応混合物） を用いる：

• プライマーは①一方のアレルに相補的、または②他方のアレルに相補的なものが作成される
• プライマーは多型部位に正確にアニールし、完全に相補的であれば→DNAポリメラーゼにとって完璧な開始点となる＝鎖の合成が開始する
• プライマーが完全に相補的でない場合＝DNAポリメラーゼは合成を開始できない＝DNAポリメラーゼは停止する

⚠️ この方法が成立するのは、Taqのように3′→5′エキソヌクレアーゼ exonuclease エキソヌクレアーゼ（exonuclease） exonuclease（エキソヌクレアーゼ） （校正proofreading校正（proofreading）proofreading（校正））活性を持たないポリメラーゼを使うときだけである。 校正proofreading 校正（proofreading）proofreading（校正） 活性のある高忠実度ポリメラーゼ（Pfu・Phusion等）を使うと、プライマー3′末端のミスマッチ mismatch (base-pair mismatch) ミスマッチ（mismatch (base-pair mismatch)） mismatch (base-pair mismatch)（ミスマッチ） 塩基が切り出されて修復され、非対応アレルからも産物が出てしまう＝アレルを判別できなくなる。「校正proofreading 校正（proofreading）proofreading（校正） しない酵素だからこそ1塩基の違いが増幅の有無に翻訳される」という、欠点を利用した設計である。

このタイプのPCRでは3種のプライマーが用いられる（外側の共通プライマー2種＋アレル特異的プライマー）。

⭐ 想起retrieval 想起（retrieval）retrieval（想起） ：

• 3′→5′エキソヌクレアーゼ活性 exonuclease activity エキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity） exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性） ＝校正 proofreading 校正（proofreading） proofreading（校正） （プルーフリーディング）： 複製の高い正確性を担う。酵素は最後に付加されたヌクレオチドが誤っていないかを認識し、誤っていれば切り出して付け直す
• 5′→3′エキソヌクレアーゼ活性 exonuclease activity エキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity） exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性） ： 酵素の前方（下流）にある岡崎フラグメント Okazaki fragment 岡崎フラグメント（Okazaki fragment） Okazaki fragment（岡崎フラグメント） のRNARNA（ribonucleic acid）プライマーを削り取りながら進み、DNAで置き換えるのを助ける（05-principles-of-the-semiconservative-dna-replication-replication-fork-leading-and参照）

DNAシークエンシング：サンガー法

DNAシークエンシング sequencing シークエンシング（sequencing） sequencing（シークエンシング） とは、DNA分子内のヌクレオチドの正確な順序を決定する過程である。DNA鎖中の4つの塩基（A、G、C、T）の順序を決定するために使われる任意の方法/技術を含む。

サンガーシークエンシングSanger sequencing サンガーシークエンシング（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガーシークエンシング） ： 鎖終結法chain-termination method 鎖終結法（chain-termination method）chain-termination method（鎖終結法） であり、ssDNA鋳型、DNAプライマー、DNAポリメラーゼ、通常のデオキシヌクレオチド deoxynucleotide (dNTP)デオキシヌクレオチド（deoxynucleotide (dNTP)） deoxynucleotide (dNTP)（デオキシヌクレオチド）、および修飾ジデオキシヌクレオチド dideoxynucleotide (ddNTP) ジデオキシヌクレオチド（dideoxynucleotide (ddNTP)） dideoxynucleotide (ddNTP)（ジデオキシヌクレオチド） を必要とする。

• ddNTPはDNA鎖の伸長を終結させる——これらのヌクレオチドはホスホジエステル phosphodiester ホスホジエステル（phosphodiester） phosphodiester（ホスホジエステル） 骨格の生成に必要な3′-OH基を欠くため→DNAポリメラーゼが伸長を継続できなくなる
• ddNTPにより終結したssDNAの長さを元の鎖と比較することで、塩基の位置を特定できる

方法： 4つの塩基の位置を決定するため4つの反応混合物 reaction mixture 反応混合物（reaction mixture） reaction mixture（反応混合物） が用意される。これらにはDNA鋳型とプライマー、4種の天然ヌクレオチド（dATP、dCTP、dGTP、dTTP）、そして1種の非天然ddNTPが加えられる。

• プライマーは通常放射性標識されており、ゲル電気泳動gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動） で断片を可視化できる
• 修飾ddNTPが取り込まれると、DNAポリメラーゼのDNA伸長が停止する
• 異なる断片はゲル電気泳動 gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis） gel electrophoresis（ゲル電気泳動） で分離できる——小さな断片ほど速く移動する→4塩基の位置を決定できる

⚠️ 上記は1977年の原法の姿であり、現在のサンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） はこの形では走っていない。 原法は放射性標識＋4本の反応・4レーン泳動だった¹が、1986年にA・C・G・Tを異なる色の蛍光色素 fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素）で区別する方式が示され、4つの反応を混ぜて単一レーンで泳動しコンピュータへ直接読み込むことが可能になった²。今日の実装は蛍光をddNTP側に付けたダイターミネーター化学＋キャピラリー電気泳動で、放射性同位体radioisotope (radioactive isotope) 放射性同位体（radioisotope (radioactive isotope)）radioisotope (radioactive isotope)（放射性同位体） もスラブゲルも使わない。変わっていないのは「ddNTPで鎖を終結させ、長さで並べて読む」という原理だけである。

💡 位置づけの変化：サンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） は「主力」から「確認用」へ移った。 候補遺伝子candidate gene 候補遺伝子（candidate gene）candidate gene（候補遺伝子） をサンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） で1本ずつ読む従来の診断手順は費用と労力がかかり、それでも約15%の症例で病的変異を同定できない。全エキソームシークエンシング sequencing シークエンシング（sequencing） sequencing（シークエンシング） （次世代シーケンサ）はこの取りこぼしを拾い、従来法で診断がつかなかった症例群で病的変異を同定できた³。一方で、NGSが見つけた変異は最終的にサンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） で確認されるのが標準的な運用であり、サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） は消えたのではなく「1変異あたりの確定用の物差し」として残っている。同じ理由で、RFLPやサザンブロット Southern blot サザンブロット（Southern blot） Southern blot（サザンブロット） も研究・診断の第一選択からは退き、教育的educational 教育的（educational）educational（教育的） な原理説明と、特定の既知多型を安く大量に型付けする場面に用途が絞られている。

プライマー伸長法

• 転写開始transcription initiation 転写開始（transcription initiation）transcription initiation（転写開始） 部位を決定するために使用される
• 遺伝子の3′側（＝転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 点より下流）の領域に相補的な放射性標識プライマーを必要とする
• プライマーをRNAへアニーリング annealing アニーリング（annealing） annealing（アニーリング） させ、逆転写酵素を用いてRNAの5′端に達するまでcDNA（相補的DNA）を合成する
• 産物をポリアクリルアミドゲルで泳動することで転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 部位を決定できる——ゲル上の配列長が開始部位から放射性標識プライマーまでの距離を表すため

⭐ 同じ「プライマー伸長」の原理は、SNPの型判定にも転用される（1塩基伸長法／ミニシークエンシング sequencingシークエンシング（sequencing） sequencing（シークエンシング））。 ただしそのときの読み取りは「どのプライマーが結合したか」ではない——プライマーは1本だけで、その3′末端が多型部位のすぐ手前で終わるように設計する。反応液に4色に色分けしたddNTPを入れると、多型部位の塩基に対応する1つだけが取り込まれて伸長が止まるので、産物の色がそのまま塩基の種類を示す。「1塩基だけ伸ばして、その色を読む」というのが本体である。

💡 転写開始transcription initiation 転写開始（transcription initiation）transcription initiation（転写開始） 部位マッピングとしてのプライマー伸長法 primer extension プライマー伸長法（primer extension） primer extension（プライマー伸長法） では、プライマーを置く位置が結果の読めるかどうかを決める。 標識プライマーは転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 点の下流（＝転写産物の5′端寄り）の、開始点にじゅうぶん近い位置でアニールさせる必要がある。逆転写酵素はそこからRNAの5′端に達するまで伸びて止まるので、産物長＝プライマー結合部位から転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 点までの距離になり、ポリアクリルアミドゲルで塩基分解能のまま長さを読める。遠くに置くと産物が長くなりすぎてゲルで分解できず、開始点を決められない。

flowchart TD
  A["同じ長さの2アレル（点変異/SNP）"] --> B["RFLP：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>認識部位の有無で切断可否が変わる→断片長の違いへ変換"]
  A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='allele-specific PCR'>アレル特異的PCR</span>：プライマー3'端の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complementation'>相補性</span>の有無→伸長の有無へ変換"]
  A --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Sanger sequencing'>サンガーシークエンシング</span>：ddNTP取り込みによる<span class='jp-term jp-term-diagram' title='chain termination'>鎖終結</span>位置→塩基配列そのものを決定"]
  A --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primer extension'>プライマー伸長法</span>：cDNA合成の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='endpoint'>終点</span>→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='transcription initiation'>転写開始</span>部位/変異部位の塩基を決定"]

まとめ

• 長さ多型は電気泳動でそのまま区別できるが、点変異/SNPは長さが同一であるため、配列の違いを長さ・有無の違いへ変換する追加の手法が必要となる。
• RFLPは制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） 認識部位がSNVにより破壊される/保たれるかを利用し、断片長の違いとして多型を可視化する。
• アレル特異的PCRallele-specific PCR アレル特異的PCR（allele-specific PCR）allele-specific PCR（アレル特異的PCR） はプライマー3′末端の相補性 complementation 相補性（complementation） complementation（相補性） の有無を利用し、完全一致のみDNAポリメラーゼが伸長を開始できる原理でアレルを判別する。
• サンガー法Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法） はddNTPによる鎖終結 chain termination 鎖終結（chain termination） chain termination（鎖終結） （3′-OH欠如）を利用して塩基配列そのものを決定し、プライマー伸長法primer extension プライマー伸長法（primer extension）primer extension（プライマー伸長法） は放射性標識プライマーからのcDNA合成距離により転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 部位を特定する（1塩基伸長法として使うときは、取り込まれたddNTPの色が多型部位の塩基を示す）。
• 検出原理は変わらないが実装と位置づけは動いている：サンガー法 Sanger sequencing サンガー法（Sanger sequencing） Sanger sequencing（サンガー法） は放射性・4レーンから蛍光ダイターミネーター＋キャピラリー電気泳動へ移り、変異探索の主役は次世代シーケンサに譲って「確定のための1変異読み」に役割が絞られた。RFLP・サザンブロットSouthern blot サザンブロット（Southern blot）Southern blot（サザンブロット） も同様に第一選択からは退いている。