組換えDNAの作製と応用、レポーターベクターと発現ベクター

🧠 組換えDNA技術は「ベクター（運び手）＋インサート insert インサート（insert） insert（インサート） （積み荷）」という単純な組み合わせを、制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） の非対称切断による「粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端）」が正確な向きでの連結を保証することで実現している。 レポーターベクターreporter vector レポーターベクター（reporter vector）reporter vector（レポーターベクター） は「プロモーターの強さを光の量として読む」変換装置、発現ベクターexpression vector 発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター） は「宿主細胞をタンパク質工場 factories 工場（factories） factories（工場） に変える」実装装置——同じベクター骨格の上に異なる目的（測定 vs 生産）を載せた2つの応用形である。

組換えDNA（recombinant DNA, rDNA）とは

組換えDNA分子は、遺伝的組換え（分子クローニングmolecular cloning 分子クローニング（molecular cloning）molecular cloning（分子クローニング） など）の実験室的手法により、複数の由来から遺伝物質 hereditary material 遺伝物質（hereditary material） hereditary material（遺伝物質） を組み合わせて形成されたDNA分子であり、通常はゲノム中に見られない配列を作り出す。

組換えDNA＝インサート insert インサート（insert） insert（インサート） DNA＋ベクターDNA→別の細胞にタンパク質を産生させる

クローニングベクター

ウイルスまたはプラスミド（naturally occurring な細菌の染色体外・自己複製性・環状二本鎖DNAcircular double-stranded DNA 環状二本鎖DNA（circular double-stranded DNA）circular double-stranded DNA（環状二本鎖DNA） 分子）から取られた小さな環状DNA片で、細胞外で維持・複製可能であり、クローニングcloning クローニング（cloning）cloning（クローニング） 目的で外来DNA断片（インサートinsertインサート（insert）insert（インサート））を挿入できる。

ベクターの機能に必要な4つのDNAセグメント：

インサート

ベクターへ挿入される目的配列（遺伝子）で、目的タンパク質をコードする。インサートinsert インサート（insert）insert（インサート） は通常PCR反応により増幅される。

分子クローニング

組換えDNA＝インサート insert インサート（insert） insert（インサート） DNA＋ベクターDNA→別の細胞にタンパク質を産生させる

1. 適切なベクターを見つける
2. インサートinsert インサート（insert）insert（インサート） を準備する→タンパク質をコード
3. ライゲーションligation ライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション） （連結）： 制限エンドヌクレアーゼrestriction endonuclease 制限エンドヌクレアーゼ（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限エンドヌクレアーゼ） で両端を適合させる
4. 形質転換： 組換えDNAを細菌細胞 bacteria 細菌細胞（bacteria） bacteria（細菌細胞） へ導入する
5. コロニースクリーニングcolony screeningコロニースクリーニング（colony screening）colony screening（コロニースクリーニング）

段階3：ライゲーション

ベクターとインサート insert インサート（insert） insert（インサート） の両方が揃ったら、インサートinsert インサート（insert）insert（インサート） を挿入するためベクターに切れ込みを入れる必要がある。ベクターの環状二本鎖DNA circular double-stranded DNA 環状二本鎖DNA（circular double-stranded DNA） circular double-stranded DNA（環状二本鎖DNA） を特定部位で切断する2種の異なる制限エンドヌクレアーゼ restriction endonuclease 制限エンドヌクレアーゼ（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限エンドヌクレアーゼ） を用いる。制限部位は通常短い回文配列 palindromic sequence 回文配列（palindromic sequence） palindromic sequence（回文配列） であり、両鎖が切断され遊離の3′-OH基と5′-リン酸基 phosphate groupリン酸基（phosphate group） phosphate group（リン酸基）が生成される。

⚠️ 切断端に残るのは5′-リン酸であって5′-OHではない。 ここは細かい話に見えて設計に効く——DNAリガーゼ DNA ligase DNAリガーゼ（DNA ligase） DNA ligase（DNAリガーゼ） は「一方の3′-OHと他方の5′-リン酸」の間にホスホジエステル結合 phosphodiester bond ホスホジエステル結合（phosphodiester bond） phosphodiester bond（ホスホジエステル結合） を作るので、5′-リン酸が無い末端は繋がらない。この性質を逆手に取り、切断したベクターをアルカリホスファターゼ alkaline phosphatase (ALP) アルカリホスファターゼ（alkaline phosphatase (ALP)） alkaline phosphatase (ALP)（アルカリホスファターゼ） で処理して5′-リン酸を外しておくと、ベクター同士の自己閉環（インサートinsert インサート（insert）insert（インサート） の入っていない空ベクター empty vector空ベクター（empty vector） empty vector（空ベクター））を抑えられる。

• 2本の鎖が非対称に切断されることが重要である——これによりベクター中の切断DNAの粘着末端 sticky end 粘着末端（sticky end） sticky end（粘着末端） （異なる長さの切断）が互いに相補的にならないようにする
• ベクターを切断するのと同じ制限エンドヌクレアーゼ restriction endonuclease 制限エンドヌクレアーゼ（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限エンドヌクレアーゼ） がインサート insert インサート（insert） insert（インサート） （標的DNA）も切断する
• ライゲーションligation ライゲーション（ligation）ligation（ライゲーション） ： 切断されたベクターとインサート insert インサート（insert） insert（インサート） をDNAリガーゼ DNA ligase DNAリガーゼ（DNA ligase） DNA ligase（DNAリガーゼ） の存在下で混合すると、ホスホジエステル結合phosphodiester bond ホスホジエステル結合（phosphodiester bond）phosphodiester bond（ホスホジエステル結合） によりDNA断片の末端を共有結合的に連結する（ATPを要する反応）→組換えDNAが形成される

段階4：形質転換

組換えDNAを作製した後、ベクター-インサート insert インサート（insert） insert（インサート） 構築物を宿主細胞（コンピテントcompetent (cell, as in transformation) コンピテント（competent (cell, as in transformation)）competent (cell, as in transformation)（コンピテント） 細菌細胞 bacteria細菌細胞（bacteria） bacteria（細菌細胞））へ、化学的または電気的方法で導入できる。

組換えDNAが真核細胞 eukaryote 真核細胞（eukaryote） eukaryote（真核細胞） へ入る手順は「トランスフェクションtransfectionトランスフェクション（transfection）transfection（トランスフェクション）」と呼ばれる。

⚠️ トランスフェクションtransfection トランスフェクション（transfection）transfection（トランスフェクション） とトランスダクション transduction トランスダクション（transduction） transduction（トランスダクション） （形質導入transduction形質導入（transduction）transduction（形質導入））は別語である。 トランスフェクションtransfection トランスフェクション（transfection）transfection（トランスフェクション） はウイルスを使わずに核酸を真核細胞 eukaryote 真核細胞（eukaryote） eukaryote（真核細胞） へ入れる操作を指し、リン酸カルシウムcalcium phosphate リン酸カルシウム（calcium phosphate）calcium phosphate（リン酸カルシウム） 共沈・カチオンcation カチオン（cation）cation（カチオン） 性脂質（リポフェクションlipofectionリポフェクション（lipofection）lipofection（リポフェクション））・エレクトロポレーションelectroporationエレクトロポレーション（electroporation）electroporation（エレクトロポレーション）・マイクロインジェクションmicroinjection マイクロインジェクション（microinjection）microinjection（マイクロインジェクション） などが該当する。これに対し、ウイルスやウイルス様粒子 virus-like particle, VLP ウイルス様粒子（virus-like particle, VLP） virus-like particle, VLP（ウイルス様粒子） にDNAを詰めて感染様の過程で送り込む方法はトランスダクションtransduction トランスダクション（transduction）transduction（トランスダクション） （形質導入transduction形質導入（transduction）transduction（形質導入））と呼び、レトロウイルス・レンチウイルス・アデノ随伴ウイルスadeno-associated virus (AAV) アデノ随伴ウイルス（adeno-associated virus (AAV)）adeno-associated virus (AAV)（アデノ随伴ウイルス） のベクターがこれにあたる。細菌側の用語である形質転換（トランスフォーメーション）も含め、この3語は「誰が運ぶか」で使い分ける。

段階5：コロニースクリーニング

組換えDNAを含む細胞は液体増殖培地の細胞培養 cell culture 細胞培養（cell culture） cell culture（細胞培養） に置かれる→外来DNAのタンパク質合成を促進する。細菌細胞bacteria 細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞） のコロニーは急速に分裂し、組換えタンパクrecombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein）recombinant protein（組換えタンパク） 質が大量に合成される。

産生させたいタンパク質はその後アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）によって精製 purification 精製（purification） purification（精製） できる（タンパク質の分離）。固定相は標的タンパク質に強く結合する性質（例：リガンド結合 ligand bindingリガンド結合（ligand binding） ligand binding（リガンド結合）、抗体-抗原相互作用）を持ち、他の物質には弱くしか結合しないため、緩衝液で洗浄除去できる。

組換えDNAの応用

インスリンは組換え技術によって生成された最初の医薬品である。治療用のヒト成長ホルモンhuman growth hormone (hGH)ヒト成長ホルモン（human growth hormone (hGH)）human growth hormone (hGH)（ヒト成長ホルモン）も組換えDNAにより作られる。

• 遺伝子治療： 機能を欠く細胞に機能的遺伝子を供給する
• 組換えタンパクrecombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein）recombinant protein（組換えタンパク） 質の産生： クローン化された遺伝子がコードするタンパク質の産生——例えば医療用途で欠損した血液凝固 blood coagulation 血液凝固（blood coagulation） blood coagulation（血液凝固） 因子など

レポーター遺伝子（ベクター）

レポーター遺伝子は、細胞に挿入されたDNA構築物の一部であることが多い遺伝子である。

• これらのベクターは調節領域の解析に用いられる
• 特定の遺伝子がレポーターとして選ばれるのは、それを発現する生物に付与する特性が容易に同定・測定できるため——または選択マーカー selectable marker 選択マーカー（selectable marker） selectable marker（選択マーカー） であるため
• レポーター遺伝子は、ある遺伝子が細胞/生物集団に取り込まれた/発現したかどうかの指標としてよく用いられる（例：pGL3ベクター）
• レポーター遺伝子を用いることで、DNA構築物を導入した細胞内での産物の濃度/量を精密に測定できる
• 例：ルシフェラーゼ luciferase ルシフェラーゼ（luciferase） luciferase（ルシフェラーゼ） 遺伝子——発光を産生する→光強度が高い＝転写活性 transcriptional activity 転写活性（transcriptional activity） transcriptional activity（転写活性） が高い（強いプロモーター）

💡 レポーターは「発光系」と「蛍光系」の2系統で覚える。 ①発光（ルシフェラーゼluciferaseルシフェラーゼ（luciferase）luciferase（ルシフェラーゼ））系——基質（ホタル型はルシフェリン＋ATP）を加えて測る破壊的アッセイだが、細胞内に背景の発光が無いためダイナミックレンジ dynamic range ダイナミックレンジ（dynamic range） dynamic range（ダイナミックレンジ） が極めて広く、プロモーター活性の定量に向く。実務ではホタルルシフェラーゼ luciferase ルシフェラーゼ（luciferase） luciferase（ルシフェラーゼ） （目的プロモーター）とウミシイタケルシフェラーゼ luciferase ルシフェラーゼ（luciferase） luciferase（ルシフェラーゼ） （恒常プロモーターの内部標準）を同じ細胞に入れ、比を取る「デュアルルシフェラーゼdual-luciferaseデュアルルシフェラーゼ（dual-luciferase）dual-luciferase（デュアルルシフェラーゼ）」が標準形で、これによりトランスフェクション transfection トランスフェクション（transfection） transfection（トランスフェクション） 効率のばらつきを打ち消す。より新しいNanoLucは深海エビ由来の19 kDa酵素と新規基質フリマジンの組み合わせで、ホタル型・ウミシイタケ型より比活性 specific activity 比活性（specific activity） specific activity（比活性） が約150倍高く、ATP非依存性で低発現の内在プロモーターも追える¹。②蛍光（GFP）系——オワンクラゲ由来のGFPは外来の基質も補因子も要らず、原核細胞Prokaryote 原核細胞（Prokaryote）Prokaryote（原核細胞） でも真核細胞 eukaryote 真核細胞（eukaryote） eukaryote（真核細胞） でも発現させるだけで光るため、生きた細胞・個体のまま発現とタンパク質局在を追える²。定量精度ではルシフェラーゼ luciferase ルシフェラーゼ（luciferase） luciferase（ルシフェラーゼ） に劣るが、1細胞ごとの観察・フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） による選別・融合タンパク質fusion protein 融合タンパク質（fusion protein）fusion protein（融合タンパク質） としての局在解析ができるのはこちら側の強みで、その後の変異体（EGFP・mCherry等の色違い、pH・カルシウム・電位センサーvoltage sensor電位センサー（voltage sensor）voltage sensor（電位センサー））の土台になった。

発現ベクター

発現ベクターexpression vector 発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター） は、標的細胞target cell標的細胞（target cell）target cell（標的細胞）/生物内での遺伝子のmRNA・タンパク質への実際の発現に関連する。

• 発現ベクターexpression vector 発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター） はエンハンサー enhancerエンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー）・プロモーター領域promoter region プロモーター領域（promoter region）promoter region（プロモーター領域） として機能する調節配列 regulatory sequence 調節配列（regulatory sequence） regulatory sequence（調節配列） を含み、遺伝子の効率的な転写を導く
• ベクターは遺伝子発現に必要な要素を持たなければならない：プロモーター、正しい翻訳開始 translation initiation 翻訳開始（translation initiation） translation initiation（翻訳開始） 配列（リボソーム結合部位ribosome binding siteリボソーム結合部位（ribosome binding site）ribosome binding site（リボソーム結合部位）、開始コドンstart codon開始コドン（start codon）start codon（開始コドン））、終結コドン、転写終結配列
• よく設計された発現ベクター expression vector 発現ベクター（expression vector） expression vector（発現ベクター） の目標は効率的なタンパク質産生であり、これは安定なmRNAを大量に産生すること→それが翻訳されタンパク質になることで達成される
• 発現ベクターexpression vector 発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター） の例：pcDNA 3.1——哺乳類 mammal 哺乳類（mammal） mammal（哺乳類） 発現ベクター expression vector発現ベクター（expression vector） expression vector（発現ベクター）

💡 構築の作法自体も、制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） ＋リガーゼ ligase リガーゼ（ligase） ligase（リガーゼ） だけではなくなっている。 上で述べた「制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） で切って粘着末端 sticky end 粘着末端（sticky end） sticky end（粘着末端） で繋ぐ」方式は、①ベクターとインサート insert インサート（insert） insert（インサート） の内部に同じ認識配列があると使えない、②繋ぎ目に制限部位由来の余分な数塩基が残る、③一度に繋げる断片数が限られる、という制約 Limitations 制約（Limitations） Limitations（制約） を持つ。これを外すために、末端どうしを重複配列で設計し、5′エキソヌクレアーゼ exonucleaseエキソヌクレアーゼ（exonuclease） exonuclease（エキソヌクレアーゼ）・DNAポリメラーゼ・DNAリガーゼDNA ligase DNAリガーゼ（DNA ligase）DNA ligase（DNAリガーゼ） を1本の等温反応で同時に働かせて継ぎ目なく連結する方法（Gibsonアセンブリ）が2009年に示され、数百キロ塩基規模の構築物やゲノム全体の合成まで可能になった³。原理を学ぶ骨格は依然として制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） -リガーゼ ligase リガーゼ（ligase） ligase（リガーゼ） 方式だが、実験室の既定手段は配列非依存のアセンブリ法へ移っている。

flowchart TD
  A["ベクター準備：ORI+MCS+<span class='jp-term jp-term-diagram' title='selectable marker'>選択マーカー</span>+タグ遺伝子"] --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>で非対称切断→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sticky end'>粘着末端</span>形成"]
  B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='insert'>インサート</span>準備：PCRで目的遺伝子を増幅"] --> C
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ligation'>ライゲーション</span>：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='DNA ligase'>DNAリガーゼ</span>が末端を共有結合的に連結"]
  D --> E["形質転換：化学的（Ca2+/熱ショック）または電気的に<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competent (cell, as in transformation)'>コンピテント</span>細菌へ導入"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='colony screening'>コロニースクリーニング</span>：液体培養で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='recombinant protein'>組換えタンパク</span>質を大量産生"]
  F --> G["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='affinity chromatography'>アフィニティークロマトグラフィー</span>で目的タンパク質を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='purification'>精製</span>"]

まとめ

• 組換えDNAはベクター（ORI・MCS・選択マーカーselectable marker選択マーカー（selectable marker）selectable marker（選択マーカー）・タグ遺伝子を持つ環状DNA）とインサート insert インサート（insert） insert（インサート） （PCR増幅された目的遺伝子）を制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） による非対称切断（粘着末端sticky end粘着末端（sticky end）sticky end（粘着末端））とDNAリガーゼ DNA ligase DNAリガーゼ（DNA ligase） DNA ligase（DNAリガーゼ） によるライゲーション ligation ライゲーション（ligation） ligation（ライゲーション） で結合して作られる。
• 形質転換（化学的または電気的）により組換えDNAが宿主細胞へ導入され、コロニースクリーニングcolony screening コロニースクリーニング（colony screening）colony screening（コロニースクリーニング） とアフィニティークロマトグラフィー affinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography） affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） により目的タンパク質が産生・精製purification 精製（purification）purification（精製） される。
• 組換えDNA技術はインスリン・hGHなどの医薬品生産 industrial-scale pharmaceutical production医薬品生産（industrial-scale pharmaceutical production） industrial-scale pharmaceutical production（医薬品生産）、遺伝子治療、組換えタンパクrecombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein）recombinant protein（組換えタンパク） 質産生に応用される。
• レポーターベクターreporter vector レポーターベクター（reporter vector）reporter vector（レポーターベクター） （ルシフェラーゼluciferase ルシフェラーゼ（luciferase）luciferase（ルシフェラーゼ） 等）はプロモーター強度を測定可能なシグナル（発光量）に変換し、発現ベクターexpression vector 発現ベクター（expression vector）expression vector（発現ベクター） （pcDNA3.1等）は標的細胞 target cell 標的細胞（target cell） target cell（標的細胞） での効率的なタンパク質産生を目的とした調節配列 regulatory sequence 調節配列（regulatory sequence） regulatory sequence（調節配列） 一式を備える。
• レポーターは発光系（ホタル／ウミシイタケのデュアル測定、より高感度なNanoLuc）と蛍光系（基質不要で生細胞観察・選別ができるGFP系統）の2系統に分かれ、定量精度と生細胞での観察しやすさを分担している。
• 核酸を細胞へ入れる操作は、細菌なら形質転換、真核細胞eukaryote 真核細胞（eukaryote）eukaryote（真核細胞） へウイルスを使わずに入れるならトランスフェクション transfectionトランスフェクション（transfection） transfection（トランスフェクション）、ウイルスベクターviral vectors ウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター） で送り込むならトランスダクション transduction トランスダクション（transduction） transduction（トランスダクション） と呼び分ける。