ビウレット反応とエルマン法によるタンパク質の定量

🧠 この単元は「タンパク質の何を数えるか」という視点の違いで3つの手法を整理すると見通しがよい。 SSA沈殿法 precipitation method 沈殿法（precipitation method） precipitation method（沈殿法） は「タンパク質そのものの量（半定量的な濁度 turbidity濁度（turbidity） turbidity（濁度））」、ビウレットbiuret ビウレット（biuret）biuret（ビウレット） 反応は「ペプチド結合の数」を発色に変換し、エルマン法Ellman-method エルマン法（Ellman-method）Ellman-method（エルマン法） は「システイン側鎖のチオール基 thiol group チオール基（thiol group） thiol group（チオール基） だけ」を狙い撃ちして測る——同じ「タンパク質を測る」という目的でも、測定対象のレベル（分子全体／結合／特定の官能基 Group官能基（Group） Group（官能基））が異なる3つの窓であることを意識すると、それぞれの試薬の役割（SSA、Cu²⁺、DTNB）が自然につながる。

変性と沈殿の違い

変性＝ ポリペプチドの天然三次構造 tertiary structure 三次構造（tertiary structure） tertiary structure（三次構造） （3D形状）の喪失 沈殿precipitation 沈殿（precipitation）precipitation（沈殿） ＝ タンパク質の溶解性 solubility 溶解性（solubility） solubility（溶解性） の喪失

→ 変性は疎水性側鎖 hydrophobic side chain 疎水性側鎖（hydrophobic side chain） hydrophobic side chain（疎水性側鎖） を表面に露出させ、凝集を引き起こし沈殿 precipitation 沈殿（precipitation） precipitation（沈殿） につながる。沈殿precipitation 沈殿（precipitation）precipitation（沈殿） は変性を伴わずに生じることもあり、その逆もありうる。

1. 沈殿

試料の総タンパク質含量の決定は非常に重要である——タンパク質精製 purification 精製（purification） purification（精製） の効率を定量するのに役立つためである。例えば、尿タンパク（タンパク尿proteinuriaタンパク尿（proteinuria）proteinuria（タンパク尿））は腎疾患を持つ人で検出されうる。糖尿病では、タンパク尿proteinuria タンパク尿（proteinuria）proteinuria（タンパク尿） は腎症（腎疾患）の徴候でありうる。

→ 強い有機酸であるスルホサリチル酸sulfosalicylic acid (SSA)スルホサリチル酸（sulfosalicylic acid (SSA)）sulfosalicylic acid (SSA)（スルホサリチル酸）は、低濃度のタンパク質を不可逆的に沈殿 precipitation 沈殿（precipitation） precipitation（沈殿） させることができる試薬である。

SSAはその負電荷によりタンパク質の正電荷を帯びた部分に結合し、その芳香環により表面に非極性 Nonpolar 非極性（Nonpolar） Nonpolar（非極性） 層を形成する結果、水への溶解性 solubility 溶解性（solubility） solubility（溶解性） が低下しタンパク質が沈殿 precipitation 沈殿（precipitation） precipitation（沈殿） する。少量ではタンパク質は試料を「乳白色milky乳白色（milky）milky（乳白色）」にし、より高いレベルのタンパク質では顆粒を形成し管の底に沈むこともある。混濁opacity (turbidity) 混濁（opacity (turbidity)）opacity (turbidity)（混濁） の程度は微量から4+反応まで等級づけられ、タンパク質濃度の決定は半定量的である。

2. ビウレット反応

ビウレットbiuret ビウレット（biuret）biuret（ビウレット） 反応はタンパク質濃度の決定に用いられる。ビウレットbiuret ビウレット（biuret）biuret（ビウレット） 反応は生体試料中のペプチド結合に特異的である。少なくとも2つのペプチド結合（カルボアミド結合 amide bondアミド結合（amide bond） amide bond（アミド結合））を含む全ての化合物が陽性のビウレット biuret ビウレット（biuret） biuret（ビウレット） 反応を示す。反応は化合物ビウレットbiuretビウレット（biuret）biuret（ビウレット）にちなんで名付けられている——これは陽性反応を示す最も単純な分子だが、試薬の成分ではない。

→ ビウレットbiuret ビウレット（biuret）biuret（ビウレット） は加熱による2分子の尿素の縮合 condensation 縮合（condensation） condensation（縮合） により形成される。

反応の原理は、アルカリ条件下で、深青色のCu²⁺イオンがタンパク質と紫色の複合体を形成することである：

• ペプチド結合はオキソ-エノール互変異性 oxo-enol tautomerism エノール互変異性（oxo-enol tautomerism） oxo-enol tautomerism（エノール互変異性） を起こす
• 窒素に結合した水素が酸素（-OH）へ転移する
• プロトンが解離し、酸素が負に帯電する
• 1つのCu²⁺が2つの負電荷を帯びた酸素と窒素の孤立電子対と複合体を形成する→この複合体は紫色である（分光光度計spectrophotometer 分光光度計（spectrophotometer）spectrophotometer（分光光度計） により546nmで測定できる）
• 色の強度はペプチド結合の数に比例するため、総タンパク質濃度の測定に利用できる

→ この方法は0.5〜5 mg/mLのタンパク質濃度範囲で十分な感度を持つ。

実験： 各試験管にビウレット biuret ビウレット（biuret） biuret（ビウレット） 試薬（CuSO4＋NaOH）を加える。既知のタンパク質濃度（BSABSA, body surface area）と収集した吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） データに基づき検量線 calibration curve 検量線（calibration curve） calibration curve（検量線） をプロットする。その後、2つの未知タンパク質溶液の濃度を測定する→溶液濃度と吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） 値の間にほぼ線形の関係がある→ランベルト・ベールの法則により濃度を計算できる（A = εcl、A：吸光度 absorbance吸光度（absorbance） absorbance（吸光度）、ε：モル吸光係数 molar absorption coefficient モル吸光係数（molar absorption coefficient） molar absorption coefficient（モル吸光係数） [M⁻¹cm⁻¹]、c：モル濃度[M]、l：光路長 optical path length 光路長（optical path length） optical path length（光路長） [cm]）。

flowchart TD
  A["アルカリ条件下でCu2+イオンがペプチド結合と接触"] --> B["ペプチド結合のオキソ-<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oxo-enol tautomerism'>エノール互変異性</span>"]
  B --> C["窒素結合水素が酸素へ転移・プロトン解離"]
  C --> D["Cu2+が2つの負電荷酸素+窒素孤立電子対と複合体形成"]
  D --> E["紫色複合体形成（546nmで測定）"]
  E --> F["色の強度＝ペプチド結合数に比例→総タンパク質濃度を算出"]

3. エルマン法

エルマン反応はチオール thiol チオール（thiol） thiol（チオール） （-SH）基の存在/濃度を決定するために用いられる。チオール基thiol group チオール基（thiol group）thiol group（チオール基） はシステインに見出されるため、システインを含むタンパク質は陽性反応を示す。

エルマン試薬Ellman's reagent エルマン試薬（Ellman's reagent）Ellman's reagent（エルマン試薬） はジスルフィドである5,5’-ジチオビス-2-ニトロ安息香酸 nitrobenzoic acid ニトロ安息香酸（nitrobenzoic acid） nitrobenzoic acid（ニトロ安息香酸） （DTNB）である。反応の間、チオールthiol チオール（thiol）thiol（チオール） が無色のDTNBと反応する→混合ジスルフィド mixed disulfide 混合ジスルフィド（mixed disulfide） mixed disulfide（混合ジスルフィド） （TNB付加体 adduct付加体（adduct） adduct（付加体））を形成し、同時に5-チオ-2-ニトロ安息香酸 nitrobenzoic acid ニトロ安息香酸（nitrobenzoic acid） nitrobenzoic acid（ニトロ安息香酸） （TNB）を遊離させる。黄色を呈するのは中性〜アルカリ性でチオール基 thiol group チオール基（thiol group） thiol group（チオール基） が解離したTNBの二価アニオン（TNB²⁻）であって、プロトン化protonation プロトン化（protonation）protonation（プロトン化） した酸そのものではない¹——測定を中性付近の緩衝液（例：pH 7.4のリン酸緩衝液）で行うのはこのためである。

⚠️ 測れるのは「反応できる遊離チオール thiolチオール（thiol） thiol（チオール）」だけで、システインの総数ではない。 ジスルフィド結合disulfide bond ジスルフィド結合（disulfide bond）disulfide bond（ジスルフィド結合） を作っているシステインは-SHを持たないので発色せず、タンパク質内部に埋もれた-SHもDTNBが近づけなければ反応しない。実際、ウサギ筋GAPDHGAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）四量体 tetramer 四量体（tetramer） tetramer（四量体） をDTNBで滴定 titration 滴定（titration） titration（滴定） すると即座に反応するSH基 sulfhydryl group SH基（sulfhydryl group） sulfhydryl group（SH基） は2個しかなく、8 M尿素で変性させて初めてさらに7個のSH基 sulfhydryl group SH基（sulfhydryl group） sulfhydryl group（SH基） がDTNBに接近可能になる²。したがって全システインを数えたいときは、あらかじめTCEPやDTTなどの還元剤でジスルフィドを切り、必要なら変性剤で展開してから測る（TCEPはDTNBを化学量論的 stoichiometric 化学量論的（stoichiometric） stoichiometric（化学量論的） に還元して2当量のTNBを生じる）³。

黄色TNBの量は分光光度計 spectrophotometer 分光光度計（spectrophotometer） spectrophotometer（分光光度計） により412nmで決定できる。TNBの吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） は濃度と線形に変化するため、チオールthiol チオール（thiol）thiol（チオール） の濃度はモル吸光係数 molar absorption coefficient モル吸光係数（molar absorption coefficient） molar absorption coefficient（モル吸光係数） （モル吸光度 absorbance吸光度（absorbance） absorbance（吸光度））を用いて計算できる：

c = E·Vr / (ε·Vs)

（c：試料のチオール thiol チオール（thiol） thiol（チオール） 濃度[M]、E：試料の吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） [O.D.]、ε：412nmにおけるTNBのモル吸光係数 molar absorption coefficient モル吸光係数（molar absorption coefficient） molar absorption coefficient（モル吸光係数） （ε=13600）、Vr：反応容積[mL]、Vs：試料容積[mL]）。εの単位は上のランベルト・ベールの法則と同じM⁻¹cm⁻¹であり、光路長optical path length光路長（optical path length）optical path length（光路長） l = 1 cmのキュベットを前提にしてlが式から消えている。Vr/Vsは反応液で薄まったぶんを試料の濃度へ戻す希釈係数である。

⚠️ ε＝13,600は1959年のEllmanの原著値で、その後改訂されている。 この13,600 M⁻¹cm⁻¹はEllmanが1959年に報告して以来ほぼ普遍的に使われてきた値だが、2003年の再測定にもとづく推奨値は412 nmで25度において14,150 M⁻¹cm⁻¹、37度において13,800 M⁻¹cm⁻¹である（0.1 Mリン酸緩衝液、pH 7.4）¹。DTNBを化学量論的 stoichiometric 化学量論的（stoichiometric） stoichiometric（化学量論的） に還元する試薬の定量でも14,150 M⁻¹cm⁻¹が使われている³。実習の検量線 calibration curve 検量線（calibration curve） calibration curve（検量線） は標準物質で引くのでこの4%のずれは問題にならないが、TNBには温度が上がると吸収極大 absorption maximum 吸収極大（absorption maximum） absorption maximum（吸収極大） が長波長側へずれて吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） が下がるサーモクロミズムがあるので、コリンエステラーゼ活性測定のように37度で測る場合は温度に合ったεを使わないと系統誤差になる¹。

flowchart TD
  A["タンパク質中のシステインの<span class='jp-term jp-term-diagram' title='thiol'>チオール</span>（-SH）基"] --> B["無色のDTNB（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Ellman&#39;s reagent'>エルマン試薬</span>）と反応"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='mixed disulfide'>混合ジスルフィド</span>（TNB<span class='jp-term jp-term-diagram' title='adduct'>付加体</span>）形成"]
  C --> D["黄色のTNB二価アニオンが遊離"]
  D --> E["412nmでの<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span>測定"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='molar absorption coefficient'>モル吸光係数</span>を用いて<span class='jp-term jp-term-diagram' title='thiol'>チオール</span>濃度を算出"]

💡 3つの手法はいずれも「見えないタンパク質の量を、目に見える色の変化に変換する」という共通の発想に立つが、何を測っているかが異なる——SSA沈殿法 precipitation method 沈殿法（precipitation method） precipitation method（沈殿法） はタンパク質分子そのものの濁度 turbidity濁度（turbidity） turbidity（濁度）、ビウレットbiuret ビウレット（biuret）biuret（ビウレット） 反応はペプチド結合の数（＝タンパク質の骨格）、エルマン法Ellman-method エルマン法（Ellman-method）Ellman-method（エルマン法） はシステイン側鎖のチオール基 thiol group チオール基（thiol group） thiol group（チオール基） （＝特定のアミノ酸残基 amino acid residueアミノ酸残基（amino acid residue） amino acid residue（アミノ酸残基））である。目的に応じてどのレベルの情報を得たいかで手法を選ぶ。

まとめ

• SSA（スルホサリチル酸sulfosalicylic acid (SSA)スルホサリチル酸（sulfosalicylic acid (SSA)）sulfosalicylic acid (SSA)（スルホサリチル酸））はタンパク質を不可逆的に沈殿 precipitation 沈殿（precipitation） precipitation（沈殿） させ、濁度turbidity 濁度（turbidity）turbidity（濁度） の程度（陰性〜4+）による半定量的なタンパク質濃度推定に用いられる。
• ビウレットbiuret ビウレット（biuret）biuret（ビウレット） 反応はペプチド結合に特異的であり、アルカリ条件下でCu²⁺イオンとペプチド結合が紫色の複合体を形成する現象を利用して総タンパク質濃度を定量する（546nm、感度範囲0.5〜5 mg/mL）。
• エルマン法Ellman-method エルマン法（Ellman-method）Ellman-method（エルマン法） はDTNB試薬がシステインのチオール基 thiol group チオール基（thiol group） thiol group（チオール基） と反応し黄色のTNB二価アニオンを遊離させる反応を利用し、412nmでの吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） 測定によりチオール thiol チオール（thiol） thiol（チオール） （システイン含有タンパク質）濃度を定量する。測れるのは接近可能な遊離チオール thiol チオール（thiol） thiol（チオール） だけで、ジスルフィドを組んでいるシステインや埋もれた-SHは還元・変性を経なければ数に入らない。モル吸光係数molar absorption coefficient モル吸光係数（molar absorption coefficient）molar absorption coefficient（モル吸光係数） は実習では1959年由来の13,600 M⁻¹cm⁻¹を使うが、現在の推奨値は25度で14,150 M⁻¹cm⁻¹（37度では13,800 M⁻¹cm⁻¹）である。