細胞内分画の解析

🧠 この実験の核心は「各オルガネラだけに存在する分子（マーカー）」を見つけ、それを比色反応に変換して「そこにそのオルガネラがどれだけあるか」を測る、という発想である。 核はDNADNA（deoxyribonucleic acid）量、ミトコンドリアはコハク酸脱水素酵素 succinate dehydrogenaseコハク酸脱水素酵素（succinate dehydrogenase） succinate dehydrogenase（コハク酸脱水素酵素）、ミクロソーム画分Microsomal fraction ミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分） はUDPグルクロニルトランスフェラーゼ glucuronyltransferase グルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase） glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ） （ER）や5’-ヌクレオチダーゼ nucleotidase ヌクレオチダーゼ（nucleotidase） nucleotidase（ヌクレオチダーゼ） （細胞膜）、細胞質はアルギナーゼ arginase アルギナーゼ（arginase） arginase（アルギナーゼ） ——分画遠心法 differential centrifugation 分画遠心法（differential centrifugation） differential centrifugation（分画遠心法） で分けた画分の「純度purity純度（purity）purity（純度）」を、その画分に特異的な酵素活性の有無で検証するのがこの実験全体の論理である。

分画研究の目的

真核細胞eukaryote 真核細胞（eukaryote）eukaryote（真核細胞） は複数の細胞内区画 intracellular compartment 細胞内区画（intracellular compartment） intracellular compartment（細胞内区画） （核、ミトコンドリア、ER、ゴルジ、リソソーム、ペルオキシソームperoxisomeペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム）、細胞質）を含み、それぞれがその特定の区画にのみ見出される高度に特異的な高分子を含む。したがってこれらの高分子はオルガネラ特異的マーカーとみなすことができる。この実験の目的は、これらのマーカーが実際に特定の分画（区画）に特異的であることを検証することである。

マーカーには例えば、核ラミナnuclear lamina 核ラミナ（nuclear lamina）nuclear lamina（核ラミナ） や細胞質のアクチン繊維 actin filamentsアクチン繊維（actin filaments） actin filaments（アクチン繊維）、酵素、核酸がありうる。これらのマーカーは以下の手法を用いて同定できる：

• 免疫染色（免疫蛍光immunofluorescence, IF免疫蛍光（immunofluorescence, IF）immunofluorescence, IF（免疫蛍光））： 無傷の細胞や組織中のマーカーを検出できる。タンパク質は抗体により、DNAはDAPI（蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素））により検出される
• 免疫ブロット（ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット））： タンパク質を細胞内分画から単離し、SDS-PAGE（試料をその分子量ごとに分ける）で分離した後、ウェスタンブロットWestern blot ウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット） へ転写する
• 生化学的アッセイ： 細胞内分画由来の酵素を特異的基質存在下でインキュベートし、産物形成を分光光度計 spectrophotometer分光光度計（spectrophotometer） spectrophotometer（分光光度計）/蛍光光度計でモニターする（→タンパク質の単離）

💡 今は「マーカーを1つずつ測る」代わりに「全プロテオーム proteome プロテオーム（proteome） proteome（プロテオーム） を一度に地図にする」やり方がある。 複数の遠心 centrifugation 遠心（centrifugation） centrifugation（遠心） 画分を作り、各画分でのタンパク質の分布パターンを定量質量分析 mass spectrometry 質量分析（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析） で読む（分画プロファイリング）と機械学習を組み合わせると、マーカー酵素を1つずつ測らなくても数千のタンパク質の局在を一挙に決められる。HeLa細胞のDynamic Organellar Mapsでは8,700以上のタンパク質に局在と絶対コピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） が与えられ、主要オルガネラがすべて分離され、局在予測精度は92%超と見積もられている¹。本実習の「画分×マーカー酵素」は、この空間プロテオミクス proteomics プロテオミクス（proteomics） proteomics（プロテオミクス） を手作業で最小単位に縮めたものと位置づけられる。

マーカーの検出は、分画遠心法differential centrifugation分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法）と呼ばれる分画法によって単離された細胞内分画で行われる。これは細胞内オルガネラの沈降速度の違いを利用する→粗細胞抽出液からの細胞内区画 intracellular compartment 細胞内区画（intracellular compartment） intracellular compartment（細胞内区画） は増加するrpm（毎分回転数）での遠心分離 centrifugation 遠心分離（centrifugation） centrifugation（遠心分離） により分離される。沈降速度は各区画に特異的である：

⚠️ 分画遠心法differential centrifugation 分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法） が分けているのは「密度」そのものではなく「沈降速度」である。 沈降速度には粒子の大きさ・形・密度がまとめて効き、大きさの寄与が支配的になる。密度そのもので分けたいなら、スクロースsucrose スクロース（sucrose）sucrose（スクロース） やOptiPrepの密度勾配（等密度）遠心 centrifugation遠心（centrifugation） centrifugation（遠心）を重ねる必要がある。実際、ペルオキシソームperoxisome ペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム） は沈降特性が他の主要オルガネラ（特にミクロソーム microsomeミクロソーム（microsome） microsome（ミクロソーム））と近いため分画遠心 centrifugation 遠心（centrifugation） centrifugation（遠心） だけでは分離しきれず、高純度 purity 純度（purity） purity（純度） に取れているのは浮遊 buoyancy 浮遊（buoyancy） buoyancy（浮遊） 密度1.22〜1.24 g/cm³の「重い」ペルオキシソーム peroxisome ペルオキシソーム（peroxisome） peroxisome（ペルオキシソーム） だけである²。

⚠️ この4分画は理想化された図式で、実際の画分は純粋ではない。 古典的なラット rat ラット（rat） rat（ラット） 肝の分画遠心 centrifugation 遠心（centrifugation） centrifugation（遠心） はこれよりもう1段細かく、核画分・重ミトコンドリア画分・軽ミトコンドリア画分（リソソームとペルオキシソーム peroxisome ペルオキシソーム（peroxisome） peroxisome（ペルオキシソーム） が主に集まる）・ミクロソーム画分Microsomal fractionミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分）・可溶性画分の5つに分ける³。そのうえでもマーカーは1つの画分に収まらない——ラット rat ラット（rat） rat（ラット） 肝でペルオキシソーム peroxisome ペルオキシソーム（peroxisome） peroxisome（ペルオキシソーム） のマーカーであるカタラーゼは軽ミトコンドリア画分と可溶性画分の両方に濃縮され、アシル-CoAオキシダーゼは核画分に約30%が現れ、ペルオキシソームperoxisome ペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム） 膜タンパク質 membrane proteins 膜タンパク質（membrane proteins） membrane proteins（膜タンパク質） PMP70は可溶性画分を除く全画分から検出される³。つまり本実習が各画分でマーカー酵素活性を測るのは、「純粋に分かれたことを確認する」ためというよりどの画分にどれだけ混ざり込んでいるかを定量するためである。

核マーカー：ゲノムDNA

ゲノムDNAが核マーカーである。DNAの酸加水分解によりデオキシリボース ribose リボース（ribose） ribose（リボース） が得られ、これはジフェニルアミン diphenylamine ジフェニルアミン（diphenylamine） diphenylamine（ジフェニルアミン） により定量される——これが呈色縮合 condensation 縮合（condensation） condensation（縮合） 生成物（シッフ塩基＝青色）を生じる。

flowchart TD
  A["ゲノム<span class='jp-term jp-term-diagram' title='deoxyribonucleic acid'>DNA</span>"] --> B["酸加水分解"]
  B --> C["デオキシ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribose'>リボース</span>"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='diphenylamine'>ジフェニルアミン</span>との反応"]
  D --> E["呈色<span class='jp-term jp-term-diagram' title='condensation'>縮合</span>生成物（シッフ塩基、青色）"]

ミトコンドリアマーカー：コハク酸脱水素酵素

コハク酸脱水素酵素succinate dehydrogenase コハク酸脱水素酵素（succinate dehydrogenase）succinate dehydrogenase（コハク酸脱水素酵素） は内ミトコンドリア膜の酵素である。この酵素はその基質であるコハク酸 succinic acid コハク酸（succinic acid） succinic acid（コハク酸） から2つの水素原子を除去し、産物であるフマル酸 fumarate フマル酸（fumarate） fumarate（フマル酸） を生じる。これらの水素原子は酵素に強く結合したFADFAD（flavin adenine dinucleotide）補欠分子族 prosthetic group 補欠分子族（prosthetic group） prosthetic group（補欠分子族） を還元できる。

酵素活性を測定するために、FADH2を再酸化できる試薬が加えられる。この反応の間、試薬の色が変化する。用いられる試薬はINT塩化物であり、そのホルマザン formazan ホルマザン（formazan） formazan（ホルマザン） は赤色（低溶解性 solubility溶解性（solubility） solubility（溶解性））である。

INTホルマザン formazan ホルマザン（formazan） formazan（ホルマザン） を可溶化 solubilization 可溶化（solubilization） solubilization（可溶化） するために、「FTF混合液」で可溶化 solubilization 可溶化（solubilization） solubilization（可溶化） される：

• ギ酸formic acid ギ酸（formic acid）formic acid（ギ酸） （pHを低下させる）
• Triton X（界面活性剤surfactant界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤））
• ホルムアルデヒドformaldehyde ホルムアルデヒド（formaldehyde）formaldehyde（ホルムアルデヒド） （アミノ酸残基amino acid residue アミノ酸残基（amino acid residue）amino acid residue（アミノ酸残基） と反応する）

→ FTF混合液を加えることで、赤色溶液を見ることができる（INTホルマザン formazan ホルマザン（formazan） formazan（ホルマザン） が可溶化 solubilization 可溶化（solubilization） solubilization（可溶化） されるため）。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinic acid'>コハク酸</span>"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='succinate dehydrogenase'>コハク酸脱水素酵素</span>"| B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='fumarate'>フマル酸</span>+2H"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='flavin adenine dinucleotide'>FAD</span>が還元されFADH2に"]
  C --> D["INT塩化物によるFADH2の再酸化"]
  D --> E["INT<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formazan'>ホルマザン</span>（赤色、低<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubility'>溶解性</span>）形成"]
  E --> F["FTF混合液（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formic acid'>ギ酸</span>+Triton X+<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formaldehyde'>ホルムアルデヒド</span>）による<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solubilization'>可溶化</span>"]
  F --> G["赤色溶液として測定可能"]

ミクロソーム画分

ミクロソーム画分Microsomal fraction ミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分） は、ERやゴルジ膜のような大きな細胞内膜系の細胞抽出人工産物 artifact 人工産物（artifact） artifact（人工産物） である小胞を大部分含む。ペルオキシソームperoxisome ペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム） や細胞膜断片も含みうる。

ERマーカー：UDPグルクロニルトランスフェラーゼ

マーカーはUDPグルクロニルトランスフェラーゼ glucuronyltransferaseグルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase） glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ）である。人工的な黄色の基質（p-ニトロフェノール phenolフェノール（phenol） phenol（フェノール））が、UDP-グルクロン酸 glucuronic acid グルクロン酸（glucuronic acid） glucuronic acid（グルクロン酸） のグルクロン酸 glucuronic acid グルクロン酸（glucuronic acid） glucuronic acid（グルクロン酸） 部分を疎水性分子 hydrophobic molecule 疎水性分子（hydrophobic molecule） hydrophobic molecule（疎水性分子） へ転移する反応を触媒するウリジン二リン酸-グルクロノシルトランスフェラーゼ glucuronosyltransferaseグルクロノシルトランスフェラーゼ（glucuronosyltransferase） glucuronosyltransferase（グルクロノシルトランスフェラーゼ）とともに用いられる→体外への排出が容易なより親水性 hydrophilic 親水性（hydrophilic） hydrophilic（親水性） の化合物を産生する。

→ この実習系での反応産物は無色のp-ニトロフェニル nitrophenyl ニトロフェニル（nitrophenyl） nitrophenyl（ニトロフェニル） グルクロニド Morphine-6-glucuronide グルクロニド（Morphine-6-glucuronide） Morphine-6-glucuronide（グルクロニド） であり、黄色いp-ニトロフェノール phenol フェノール（phenol） phenol（フェノール） が消費されて吸光度 absorbance 吸光度（absorbance） absorbance（吸光度） が下がるぶんを酵素活性として読む。生体内in vivo 生体内（in vivo）in vivo（生体内） で同じ酵素が担う代表的な反応がビリルビンのモノ/ジグルクロニド Morphine-6-glucuronide グルクロニド（Morphine-6-glucuronide） Morphine-6-glucuronide（グルクロニド） 生成で、こちらも水溶性で無毒になり胆汁へ排泄される。p-ニトロフェノール phenol フェノール（phenol） phenol（フェノール） はその生理反応を試験管内 in vitro 試験管内（in vitro） in vitro（試験管内） で模したモデル基質であって、実習の反応産物がビリルビングルクロニド Morphine-6-glucuronide グルクロニド（Morphine-6-glucuronide） Morphine-6-glucuronide（グルクロニド） になるわけではない。

⚠️ 無傷のミクロソーム microsome ミクロソーム（microsome） microsome（ミクロソーム） 小胞では活性が「隠れて」いる。 UDPグルクロニルトランスフェラーゼ glucuronyltransferase グルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase） glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ） はER膜に埋まっており、触媒ドメインがER内腔側を向いている。そのため小胞が無傷のままでは基質もUDP-グルクロン酸 glucuronic acid グルクロン酸（glucuronic acid） glucuronic acid（グルクロン酸） も酵素に届かず、活性は潜在状態 latent 潜在状態（latent） latent（潜在状態） にとどまる。Triton X-100などの界面活性剤 surfactant 界面活性剤（surfactant） surfactant（界面活性剤） で膜の連続性 continuous 連続性（continuous） continuous（連続性） を壊して初めて全活性が現れる⁴。ミクロソーム画分Microsomal fraction ミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分） でこの酵素を測るときに界面活性剤 surfactant 界面活性剤（surfactant） surfactant（界面活性剤） を加えるのはこのためで、加え忘れると「ERマーカーが検出されない」という偽陰性になる。

細胞膜マーカー：5’-ヌクレオチダーゼ

マーカーは5’ヌクレオチダーゼ nucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase） nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）である。Fiske-Subbarow比色リン酸アッセイにより5’ヌクレオチダーゼ nucleotidase ヌクレオチダーゼ（nucleotidase） nucleotidase（ヌクレオチダーゼ） レベルを決定する。5’ヌクレオチダーゼ nucleotidase ヌクレオチダーゼ（nucleotidase） nucleotidase（ヌクレオチダーゼ） は、Mg²⁺イオン存在下でグリシン-NaOH緩衝液（pH8.5）中のAMPを用いて細胞内分画からアッセイされる。

細胞質マーカー：アルギナーゼ

マーカーはアルギナーゼarginaseアルギナーゼ（arginase）arginase（アルギナーゼ）である。哺乳類mammal 哺乳類（mammal）mammal（哺乳類） の肝臓において、アルギナーゼarginase アルギナーゼ（arginase）arginase（アルギナーゼ） は細胞質に局在し、尿素回路urea cycle 尿素回路（urea cycle）urea cycle（尿素回路） の最終酵素反応を触媒する。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='arginine (Arg)'>アルギニン</span>+H2O"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='arginase'>アルギナーゼ</span>"| B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ornithine'>オルニチン</span>+尿素"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='diacetyl'>ジアセチル</span>モノ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oxime'>オキシム</span>+チオセミカルバジドとの反応"]
  C --> D["呈色生成物"]

まとめ

• 各細胞内区画 intracellular compartment 細胞内区画（intracellular compartment） intracellular compartment（細胞内区画） は特異的なマーカー分子（核：ゲノムDNA、ミトコンドリア：コハク酸脱水素酵素 succinate dehydrogenaseコハク酸脱水素酵素（succinate dehydrogenase） succinate dehydrogenase（コハク酸脱水素酵素）、ER：UDPグルクロニルトランスフェラーゼ glucuronyltransferaseグルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase） glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ）、細胞膜：5’-ヌクレオチダーゼ nucleotidaseヌクレオチダーゼ（nucleotidase） nucleotidase（ヌクレオチダーゼ）、細胞質：アルギナーゼ arginaseアルギナーゼ（arginase） arginase（アルギナーゼ））を持ち、これらは免疫染色・ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）・生化学的アッセイにより同定される。
• 分画遠心法differential centrifugation 分画遠心法（differential centrifugation）differential centrifugation（分画遠心法） は細胞内オルガネラの沈降速度の違い（大きさが支配的で密度も効く）を利用し、増加するg値（1000→11,000→100,000→>100,000）で粗細胞抽出液を遠心分離 centrifugation 遠心分離（centrifugation） centrifugation（遠心分離） することで各分画を分離する。密度そのもので分けるには密度勾配（等密度）遠心 centrifugation 遠心（centrifugation） centrifugation（遠心） を重ねる必要があり、分画遠心 centrifugation 遠心（centrifugation） centrifugation（遠心） だけで得た画分は純粋ではない——マーカーは複数の画分にまたがって現れる。
• ミクロソーム画分Microsomal fraction ミクロソーム画分（Microsomal fraction）Microsomal fraction（ミクロソーム画分） のUDPグルクロニルトランスフェラーゼ glucuronyltransferase グルクロニルトランスフェラーゼ（glucuronyltransferase） glucuronyltransferase（グルクロニルトランスフェラーゼ） は触媒部位 catalytic site 触媒部位（catalytic site） catalytic site（触媒部位） がER内腔を向いているため、界面活性剤surfactant 界面活性剤（surfactant）surfactant（界面活性剤） で小胞膜を壊さないと活性が現れない（潜在活性）。実習の反応産物はp-ニトロフェニル nitrophenyl ニトロフェニル（nitrophenyl） nitrophenyl（ニトロフェニル） グルクロニド Morphine-6-glucuronide グルクロニド（Morphine-6-glucuronide） Morphine-6-glucuronide（グルクロニド） で、ビリルビングルクロニド Morphine-6-glucuronide グルクロニド（Morphine-6-glucuronide） Morphine-6-glucuronide（グルクロニド） は同じ酵素が生体内 in vivo 生体内（in vivo） in vivo（生体内） で担う代表反応の側である。
• 各マーカー酵素はそれぞれ特異的な比色反応（DNA→デオキシリボース ribose リボース（ribose） ribose（リボース） →ジフェニルアミン diphenylamine ジフェニルアミン（diphenylamine） diphenylamine（ジフェニルアミン） 発色、コハク酸succinic acid コハク酸（succinic acid）succinic acid（コハク酸） →フマル酸 fumarate フマル酸（fumarate） fumarate（フマル酸） →INTホルマザン formazan ホルマザン（formazan） formazan（ホルマザン） 発色など）に基づいて定量され、分画の純度 purity 純度（purity） purity（純度） を検証するために用いられる。