SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動とウェスタンブロット

🧠 SDS-PAGEの核心は「SDSが全てのタンパク質を同じ電荷密度でコーティングする」という1点にある——これにより電荷による移動速度の違いが消え、残るのはゲルの網目 mesh (network) 網目（mesh (network)） mesh (network)（網目） による「ふるい効果sieving effectふるい効果（sieving effect）sieving effect（ふるい効果）」だけになる。 つまりこの手法はタンパク質を電荷ではなくサイズだけで分離する仕組みへと変換する装置であり、ウェスタンブロットWestern blot ウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット） はその後「ゲル上のバンド」を「膜上に固定された、抗体で狙い撃ちできる標的」へ移し替える追加の一手である。一次抗体primary antibody 一次抗体（primary antibody）primary antibody（一次抗体） が標的を選び、二次抗体secondary antibody 二次抗体（secondary antibody）secondary antibody（二次抗体） が酵素を運んでシグナルを増幅する、という2段階の抗体サンドイッチが検出の感度を支えている。

電気泳動とは

電気泳動とは、荷電charged 荷電（charged）charged（荷電） した高分子（RNA、DNA、タンパク質、炭水化物）をその物理的性質 physical nature 物理的性質（physical nature） physical nature（物理的性質） に従って分離する技術である。分離は、溶液中の荷電 charged 荷電（charged） charged（荷電） 成分が電場 electric field 電場（electric field） electric field（電場） の作用下で異なる速度で移動するという事実に基づく。

SDS-PAGE

SDS-ポリアクリルアミドゲル polyacrylamide gel ポリアクリルアミドゲル（polyacrylamide gel） polyacrylamide gel（ポリアクリルアミドゲル） にはポリアクリルアミドが用いられる。SDS（ドデシル硫酸ナトリウムsodium dodecyl sulfate (SDS)ドデシル硫酸ナトリウム（sodium dodecyl sulfate (SDS)）sodium dodecyl sulfate (SDS)（ドデシル硫酸ナトリウム））は、天然タンパク質の二次的相互作用を破壊する界面活性剤 surfactant 界面活性剤（surfactant） surfactant（界面活性剤） として用いられる。SDSは2つの重要な機能を持つ：

1. タンパク質相互作用を破壊し、変性したタンパク質を可溶状態に保つ
2. 折り畳みが解けたタンパク質に大過剰で結合し、分子に追加の負電荷を与える→結果として、各タンパク質は質量あたりほぼ一定の負電荷（電荷密度）を持つようになる

⚠️ 「どれも同じ電荷」ではなく「質量あたり同じ電荷」。 SDSの結合量は配列にほとんど依存せず分子量に比例し、飽和時でアミノ酸2残基あたり約1分子、ポリペプチド1 gあたり約1.4 gのSDSが結合する¹。多様なタンパク質がg/g基準で同一量のSDSを結合することは1970年に示されている²。総電荷がそろうのではなく、電荷が質量に比例して増えることで電荷/質量比が全タンパク質で等しくなり、電荷による移動速度の差が消える。

💡 SDSだけでは変性は完結しない。 ジスルフィド結合disulfide bond ジスルフィド結合（disulfide bond）disulfide bond（ジスルフィド結合） はSDSでは切れないため、通常はジチオトレイトール dithiothreitol (DTT) ジチオトレイトール（dithiothreitol (DTT)） dithiothreitol (DTT)（ジチオトレイトール） （DTT）または2-メルカプトエタノールといった還元剤を併用し、加熱してからゲルに載せる¹。下の図の「SDS+DTT+加熱」はこの前処理を指す。

電気泳動中の異なるタンパク質の移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） は、主に多孔質 porous (coating) 多孔質（porous (coating)） porous (coating)（多孔質） ゲルのふるい効果sieving effectふるい効果（sieving effect）sieving effect（ふるい効果）によって決定される：

• 小さい分子→抵抗が小さい→移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） が大きい→移動距離 excursion (distance of movement) 移動距離（excursion (distance of movement)） excursion (distance of movement)（移動距離） が長い
• 大きい分子→抵抗が大きい→移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） が小さい→移動距離 excursion (distance of movement) 移動距離（excursion (distance of movement)） excursion (distance of movement)（移動距離） が短い

→ SDS-PAGEはタンパク質をその分子量（サイズ）に従って分離する。

本質的には、電場electric field 電場（electric field）electric field（電場） が印加され、荷電charged 荷電（charged）charged（荷電） 分子がゲル中を移動する。SDSにより電荷の効果が排除され、ゲル全体で電圧が一定とみなされるため、分子量の小さい分子はより速く移動し、大きい分子はより遅く移動する。バンドはその後既知の分子量を持つ参照物と比較され、高分子の分子量を推定できる。

⚠️ 求まるのは「見かけの分子量apparent molecular weight見かけの分子量（apparent molecular weight）apparent molecular weight（見かけの分子量）」である。 疎水性の高い配列、極端に荷電 charged 荷電（charged） charged（荷電） した配列、糖鎖付加glycosylation 糖鎖付加（glycosylation）glycosylation（糖鎖付加） やリン酸化などの翻訳後修飾 post-translational modification 翻訳後修飾（post-translational modification） post-translational modification（翻訳後修飾） は移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） を変えるため、修飾を受けたタンパク質の見かけの分子量 apparent molecular weight 見かけの分子量（apparent molecular weight） apparent molecular weight（見かけの分子量） はポリペプチド鎖の実際の質量を正しく反映しないことがある¹。

flowchart TD
  A["タンパク質試料（SDS+DTT+加熱で変性）"] --> B["SDSが<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hydrophobic interaction'>疎水性相互作用</span>を破壊し質量あたり一定の負電荷を付与"]
  B --> C["ゲルへのローディング"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='electric field'>電場</span>印加：小さい分子ほど速く・遠くまで移動（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sieving effect'>ふるい効果</span>）"]
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='molecular weight marker'>分子量マーカー</span>との比較によるサイズ推定"]

ウェスタンブロット

ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）は組織抽出物試料中の特異的タンパク specific protein 特異的タンパク（specific protein） specific protein（特異的タンパク） 質を検出するために用いられる。電気泳動が完了すると、ゲルとろ紙の間にニトロセルロース膜 nitrocellulose membrane ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane） nitrocellulose membrane（ニトロセルロース膜） がぴったりと重ねられた「サンドイッチ」が組み立てられ、特殊な装置内でゲル平面に垂直な方向にもう一度電気泳動が行われる。タンパク質はゲルから膜へ転写され、これにより抗体での標識に適した状態になる。

💡 転写膜はニトロセルロース cellulose セルロース（cellulose） cellulose（セルロース） だけではない。 現在はニトロセルロース cellulose セルロース（cellulose） cellulose（セルロース） とPVDF（ポリフッ化ビニリデンpolyvinylidene fluoride (PVDF)ポリフッ化ビニリデン（polyvinylidene fluoride (PVDF)）polyvinylidene fluoride (PVDF)（ポリフッ化ビニリデン））の2種が標準的に使われ、ウェット式・セミドライ式のいずれの転写装置でも同等に転写できる³。

検出は、ニトロセルロース膜nitrocellulose membrane ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane）nitrocellulose membrane（ニトロセルロース膜） 上に固定化されたタンパク質へ抗体を結合させることで達成される。転写されたタンパク質は抗体の組み合わせで標識される：目的タンパク質に特異的な抗体（一次抗体primary antibody一次抗体（primary antibody）primary antibody（一次抗体））と、一次抗体primary antibody 一次抗体（primary antibody）primary antibody（一次抗体） の宿主種に特異的なもう1つの抗体（二次抗体secondary antibody二次抗体（secondary antibody）secondary antibody（二次抗体））である。二次抗体secondary antibody 二次抗体（secondary antibody）secondary antibody（二次抗体） はしばしば酵素と複合体を形成しており、これが適切な基質と組み合わさると検出可能なシグナルを産生する。

💡 抗体を載せる前にブロッキング locking ロッキング（locking） locking（ロッキング） が要る。 1979年のTowbinらの原法では、膜に残った非特異的なタンパク質結合能を過剰の無関係 unrelated 無関係（unrelated） unrelated（無関係） なタンパク質であらかじめ埋めてから一次抗体 primary antibody 一次抗体（primary antibody） primary antibody（一次抗体） を、続いて抗一次抗体 primary antibody 一次抗体（primary antibody） primary antibody（一次抗体） である二次抗体 secondary antibody 二次抗体（secondary antibody） secondary antibody（二次抗体） を結合させる。二次抗体secondary antibody 二次抗体（secondary antibody）secondary antibody（二次抗体） は放射標識・フルオレセインfluorescein フルオレセイン（fluorescein）fluorescein（フルオレセイン） 標識・ペルオキシダーゼperoxidase ペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ） 結合のいずれでもよく、ペルオキシダーゼperoxidase ペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ） 反応では100 pgのタンパク質が明瞭に検出できた⁴。

💡 検出法には感度の序列がある。 発色基質chromogenic substrate 発色基質（chromogenic substrate）chromogenic substrate（発色基質） （4-クロロ-1-ナフトール naphthol ナフトール（naphthol） naphthol（ナフトール） など）による発色検出よりも増強化学発光 enhanced chemiluminescence (ECL) 増強化学発光（enhanced chemiluminescence (ECL)） enhanced chemiluminescence (ECL)（増強化学発光） （ECL）のほうが桁違いに高感度で、単純ヘルペスウイルス2型herpes simplex virus type 2 単純ヘルペスウイルス2型（herpes simplex virus type 2）herpes simplex virus type 2（単純ヘルペスウイルス2型） のウェスタンブロット Western blot ウェスタンブロット（Western blot） Western blot（ウェスタンブロット） の比較では、PVDF膜＋ECLはニトロセルロース cellulose セルロース（cellulose） cellulose（セルロース） ＋発色法の最大500倍の感度を示した⁵。このため高感度検出の主軸は酵素標識 enzyme label 酵素標識（enzyme label） enzyme label（酵素標識） 二次抗体 secondary antibody 二次抗体（secondary antibody） secondary antibody（二次抗体） ＋化学発光 chemiluminescence 化学発光（chemiluminescence） chemiluminescence（化学発光） である。

flowchart TD
  A["SDS-PAGEで分離されたタンパク質を含むゲル"] --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nitrocellulose membrane'>ニトロセルロース膜</span>またはPVDF膜へのサンドイッチ形成"]
  B --> C["ゲルに垂直な方向の電気泳動でタンパク質を膜へ転写"]
  C --> Bl["ブ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='locking'>ロッキング</span>：残った<span class='jp-term jp-term-diagram' title='aspecific binding'>非特異的結合</span>能を過剰タンパク質で埋める"]
  Bl --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primary antibody'>一次抗体</span>：目的タンパク質に特異的に結合"]
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='secondary antibody'>二次抗体</span>：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primary antibody'>一次抗体</span>の宿主種に特異的に結合、酵素と複合体化"]
  E --> F["酵素基質反応による検出可能なシグナル産生"]

まとめ

• SDS-PAGEはSDSがタンパク質を変性させ、質量あたり一定の負電荷を付与することで電荷/質量比をそろえ、多孔質porous (coating) 多孔質（porous (coating)）porous (coating)（多孔質） ゲルのふるい効果 sieving effect ふるい効果（sieving effect） sieving effect（ふるい効果） のみによって分子量に基づく分離を可能にする（還元剤と加熱を併用してジスルフィド結合 disulfide bond ジスルフィド結合（disulfide bond） disulfide bond（ジスルフィド結合） も切る）。得られるのは見かけの分子量 apparent molecular weight 見かけの分子量（apparent molecular weight） apparent molecular weight（見かけの分子量） で、糖鎖付加glycosylation 糖鎖付加（glycosylation）glycosylation（糖鎖付加） やリン酸化があるとずれる。
• ウェスタンブロットWestern blot ウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット） はSDS-PAGEで分離したタンパク質をニトロセルロース膜 nitrocellulose membrane ニトロセルロース膜（nitrocellulose membrane） nitrocellulose membrane（ニトロセルロース膜） またはPVDF膜へ転写し、ブロッキング locking ロッキング（locking） locking（ロッキング） ののち一次抗体 primary antibody 一次抗体（primary antibody） primary antibody（一次抗体） （目的タンパク質特異的）と二次抗体 secondary antibody 二次抗体（secondary antibody） secondary antibody（二次抗体） （酵素標識enzyme label酵素標識（enzyme label）enzyme label（酵素標識）、一次抗体primary antibody 一次抗体（primary antibody）primary antibody（一次抗体） の宿主種特異的）の組み合わせにより特異的タンパク specific protein 特異的タンパク（specific protein） specific protein（特異的タンパク） 質を検出する。