アフィニティークロマトグラフィーによる細菌発現タンパク質の精製

🧠 アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） の核心は「ヒスチジンhistidine ヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン） 残基がニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） イオンと配位結合 coordinate bond 配位結合（coordinate bond） coordinate bond（配位結合） を作る」という1つの化学的事実であり、この単元全体はその1点をどう使い倒すかというストーリーである。 6×Hisタグを持つ標的タンパク質だけがニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） 樹脂に強く結合し、他の宿主タンパク質は洗い流される——そして溶出は「もっと強い結合」ではなく「イミダゾールimidazole イミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール） という競合分子を大量に投入して数で押し切る」という発想で行われる。20mMでは6×Hisタグの親和性に負けて洗浄液に留まり、500mMでは濃度差 concentration difference 濃度差（concentration difference） concentration difference（濃度差） で6×His-YFPを追い出す、という同じ試薬（イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール））の濃度だけを変えた2段階操作である点がこの精製 purification 精製（purification） purification（精製） 法の巧妙さである。

組換えタンパク質産生の背景

人工的なDNADNA（deoxyribonucleic acid）配列（組換えDNA）が適切なタンパク質過剰発現 overexpression 過剰発現（overexpression） overexpression（過剰発現） ベクターへ挿入される。ベクターは原核/真核宿主細胞へ導入され、組換えタンパクrecombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein）recombinant protein（組換えタンパク） 質の発現を誘導できる。

使用前に、標的タンパク質は宿主細胞の無用だが豊富な内因性タンパク質から分離されなければならない。タンパク質精製 purification 精製（purification） purification（精製） はアフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatographyアフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー）のような特殊なクロマトグラフィー chromatography クロマトグラフィー（chromatography） chromatography（クロマトグラフィー） アッセイにより行われる——これは1段階で高純度 purity 純度（purity） purity（純度） の精製 purification 精製（purification） purification（精製） を達成するために用いられるツールである。したがって組換えタンパク recombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein） recombinant protein（組換えタンパク） 質は、アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） の適用を可能にする短いアミノ酸配列 amino-acid sequence アミノ酸配列（amino-acid sequence） amino-acid sequence（アミノ酸配列） でタグ付けされることが多い。

実験

この実験の目的は、大腸菌細胞内で発現した黄色蛍光タンパク質yellow fluorescent protein (YFP)黄色蛍光タンパク質（yellow fluorescent protein (YFP)）yellow fluorescent protein (YFP)（黄色蛍光タンパク質）を精製 purification 精製（purification） purification（精製） することである。YFPはそのN末端に6つの連続したヒスチジン histidine ヒスチジン（histidine） histidine（ヒスチジン） 残基（6×His）でタグ付けされており、アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） に基づく精製 purification 精製（purification） purification（精製） を可能にする。

誘導の成功はUV光による細胞懸濁液 suspension 懸濁液（suspension） suspension（懸濁液） の照射によって検出できる。誘導後、細菌細胞bacteria 細菌細胞（bacteria）bacteria（細菌細胞） は低速遠心分離 centrifugation 遠心分離（centrifugation） centrifugation（遠心分離） 段階により培養ブロスから分離できる。遠心分離centrifugation 遠心分離（centrifugation）centrifugation（遠心分離） により管の底に細菌ペレットが、上部に液体上清 supernatant 上清（supernatant） supernatant（上清） が得られる。両相をUV光下で調べることで、誘導された細菌ペレットが最も強い蛍光を発することが観察できる。

6×His-YFPを複雑なマトリックスから分離するため、最初の作業は細胞を開くこと：(1)細胞壁と膜を破壊する細胞溶解cytolysis細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解）、続いて(2)アフィニティークロマトグラフィー affinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography） affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） による標的タンパク質の単離。

1. 細胞溶解

溶解液の主成分 main component 主成分（main component） main component（主成分） ：リン酸緩衝液、塩化ナトリウムsodium chloride塩化ナトリウム（sodium chloride）sodium chloride（塩化ナトリウム）、リゾチームlysozymeリゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム）、DNase。

• リン酸緩衝液は溶解に最適なpH（pH=8）を保証し、NaClは適切なイオン強度を提供し、リゾチームlysozyme リゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム） とDNase酵素が細胞溶解 cytolysis 細胞溶解（cytolysis） cytolysis（細胞溶解） を促進する
• 細胞壁と膜の破壊は染色体DNAの放出を引き起こす→懸濁液 suspension 懸濁液（suspension） suspension（懸濁液） の粘度を大幅に増加させる→溶解液に加えられたDNaseが放出された染色体DNAを切断し、溶液の粘度を低下させる
• 再懸濁後、細胞溶解cytolysis 細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解） 物は最大rpmで遠心分離 centrifugation 遠心分離（centrifugation） centrifugation（遠心分離） され、より大きな細菌デブリ debris デブリ（debris） debris（デブリ） （例：細胞膜、細胞壁断片）や不溶性粒子を管の底へ沈降させる一方、可溶性タンパク質（6×His-YFP）は上清 supernatant 上清（supernatant） supernatant（上清） に残る
• この段階で、誘導された試料の上清 supernatant 上清（supernatant） supernatant（上清） はUV下でより高い蛍光を示す。誘導された試料の上清 supernatant 上清（supernatant） supernatant（上清） （溶解物）がアフィニティークロマトグラフィー affinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography） affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） 精製 purification 精製（purification） purification（精製） に用いられる

⚠️ 粘度を下げているのはDNaseによるDNAの分解であって、RNARNA（ribonucleic acid）の分解ではない。 DNaseの基質はDNAだけで、RNAには作用しない（RNAを除きたければ別にRNaseを加える）。そもそも溶解液が糸を引くほど粘くなる原因は、数百万塩基対 base pairing 塩基対（base pairing） base pairing（塩基対） に及ぶ環状染色体 ring chromosome 環状染色体（ring chromosome） ring chromosome（環状染色体） DNAが放出されて絡み合うことにあり、RNAは短いので粘度への寄与は小さい。

2. アフィニティークロマトグラフィー

クロマトグラフィーchromatography クロマトグラフィー（chromatography）chromatography（クロマトグラフィー） はタンパク質の分離に用いられる。クロマトグラフィーchromatography クロマトグラフィー（chromatography）chromatography（クロマトグラフィー） 系は固定相（例：紙、ガラス、樹脂、ビーズ）と、固定相を通過する移動相（溶媒と分離される分子）を含む。固定相は通常カラムに詰められる。

アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） の場合、標的分子への高い親和性を持つリガンドと結合した固定相（ビーズ、樹脂）を用いる。リガンドは通常固相（例：アガロース agarose アガロース（agarose） agarose（アガロース） ビーズ）に固定化される。

精製purification 精製（purification）purification（精製） の基盤は、ヒスチジンhistidine ヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン） アミノ酸残基 amino acid residue アミノ酸残基（amino acid residue） amino acid residue（アミノ酸残基） がニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） と配位結合 coordinate bond 配位結合（coordinate bond） coordinate bond（配位結合） を形成できることである。樹脂（アガロースagaroseアガロース（agarose）agarose（アガロース））に特異的に結合したタンパク質は、低pHグリシン緩衝液または競合物質（ヒスチジンhistidineヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン）/イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール））により溶出できる。精製purification 精製（purification）purification（精製） に用いるマイクロスピン spin スピン（spin） spin（スピン） カラムは、精製purification 精製（purification）purification（精製） に用いるビーズを含むポリエチレンフィルター barrier フィルター（barrier） barrier（フィルター） を含む。

💡 ニッケルnickel ニッケル（nickel）nickel（ニッケル） は樹脂に直接くっついているのではなく、キレートchelation キレート（chelation）chelation（キレート） 剤に「4本の手」で押さえられている。 アガロースagarose アガロース（agarose）agarose（アガロース） に固定されているのはニトリロ三酢酸（NTA）という四座配位子 ligand 配位子（ligand） ligand（配位子） で、Ni²⁺の配位数 coordination number 配位数（coordination number） coordination number（配位数） は6であるから、NTAが4座を占めてもなお2座が空いたまま残る。この2座にHisタグのイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） 窒素が可逆的に配位 coordinate 配位（coordinate） coordinate（配位） する——これがNi-NTA樹脂が隣接ヒスチジン histidine ヒスチジン（histidine） histidine（ヒスチジン） 残基に選択的である理由である。より古いイミノ二酢酸（IDA）樹脂は三座で金属の保持が弱い¹。そしてイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） で溶出できるのは、イミダゾールimidazole イミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール） がヒスチジン histidine ヒスチジン（histidine） histidine（ヒスチジン） 側鎖そのものの化学構造をしていて、同じ空き2座を奪い合えるからである。

flowchart TD
  A["結合：6xHis-YFPを含む溶解物を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nickel'>ニッケル</span>樹脂に通す"] --> B["6xHisが<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nickel'>ニッケル</span>に<span class='jp-term jp-term-diagram' title='coordinate bond'>配位結合</span>"]
  B --> C["洗浄：低濃度<span class='jp-term jp-term-diagram' title='imidazole'>イミダゾール</span>（20mM）で他のタンパク質を除去"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='Elute'>溶出</span>：高濃度<span class='jp-term jp-term-diagram' title='imidazole'>イミダゾール</span>（500mM）で6xHis-YFPを<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competitive'>競合的</span>に追い出す"]
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='purification'>精製</span>された6xHis-YFPの回収"]

精製に用いる3種の溶液

1. 平衡化/溶解溶液（結合、Bind）： 溶解に用いたリゾチーム lysozyme リゾチーム（lysozyme） lysozyme（リゾチーム） とDNase酵素を除く溶解溶液の全成分を含み、Hisタグ付きタンパク質を類似の溶液内で結合させるためカラムを準備する
2. 洗浄溶液： 平衡化緩衝液と同じ成分を持つが、ビーズから特異的に結合していないタンパク質を除去するため低濃度のイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） （20mM）を含む。イミダゾールimidazole イミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール） は6×Hisの競合物質として働くが、ニッケルnickel ニッケル（nickel）nickel（ニッケル） イオンへの親和性は6×Hisタグ付きタンパク質のそれより低いままである。6つのヒスチジン histidine ヒスチジン（histidine） histidine（ヒスチジン） のニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） イオンへの高い親和性のため、6×His-YFPは20mMイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） 濃度でもビーズに安定に結合し続ける
3. 溶出溶液： 平衡化緩衝液と同じ成分を持つが、高濃度のイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） （500mM）を含む。ヘキサヒスチジン histidine ヒスチジン（histidine） histidine（ヒスチジン） タグのニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） イオンへの親和性はイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） のそれよりはるかに高いが、高濃度により、ビーズに結合した6×His-YFPを競合的 competitive 競合的（competitive） competitive（競合的） に追い出すことができる。数分間のインキュベーション後、溶出された6×His-YFPはUV光下で管底の蛍光リングとして観察できる。

⚠️ 「1段階で高純度 purity純度（purity） purity（純度）」は理想であって、実際のIMAC溶出液 eluate 溶出液（eluate） eluate（溶出液） には必ず宿主タンパク質が混じる。 大腸菌には、Hisタグを持たないのにニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） 樹脂へ弱く結合してしまうタンパク質がある。代表格がSlyD（ペプチジルプロリル prolyl プロリル（prolyl） prolyl（プロリル） シス-トランス異性化酵素 isomerase異性化酵素（isomerase） isomerase（異性化酵素））で、そもそも6×Hisタグタンパク質を非変性条件のIMACで精製 purification 精製（purification） purification（精製） したときの主要な夾雑物として発見された経緯を持ち、変性条件のIMACすら汚染しうる²。トリオースリン酸イソメラーゼtriose phosphate isomerase トリオースリン酸イソメラーゼ（triose phosphate isomerase）triose phosphate isomerase（トリオースリン酸イソメラーゼ） も同様で、ごく微量でも結晶化 crystallization 結晶化（crystallization） crystallization（結晶化） を妨げるほど高頻度に共精製 purification 精製（purification） purification（精製） される³。だから実際の精製 purification 精製（purification） purification（精製） では、IMACのあとにイオン交換やゲル濾過 gel filtration ゲル濾過（gel filtration） gel filtration（ゲル濾過） をもう1段重ねるのが普通である。実習でIMAC1回で済むのは、YFPが蛍光で追えるうえに要求される純度 purity 純度（purity） purity（純度） が高くないからである。

💡 洗浄段階と溶出段階は同じ試薬（イミダゾールimidazoleイミダゾール（imidazole）imidazole（イミダゾール））の濃度だけを変えた操作である。 20mMでは6×Hisタグの圧倒的な親和性に負けてイミダゾール imidazole イミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール） だけが洗い流され、500mMでは濃度差 concentration difference 濃度差（concentration difference） concentration difference（濃度差） （質量作用）によって6×His-YFPさえも競合的 competitive 競合的（competitive） competitive（競合的） に追い出される——「親和性の強さ」ではなく「濃度による数の力」で溶出を達成する点がアフィニティークロマトグラフィー affinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography） affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） の実践的なコツである。

まとめ

• 組換えタンパクrecombinant protein 組換えタンパク（recombinant protein）recombinant protein（組換えタンパク） 質産生では、目的タンパク質を短いアミノ酸タグ（例：6×His）でマークし、アフィニティークロマトグラフィーaffinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography）affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） により1段階で高純度 purity 純度（purity） purity（純度） に精製 purification 精製（purification） purification（精製） する。ただし「1段階で高純度 purity純度（purity） purity（純度）」は理想で、大腸菌のSlyDやトリオースリン酸イソメラーゼ triose phosphate isomerase トリオースリン酸イソメラーゼ（triose phosphate isomerase） triose phosphate isomerase（トリオースリン酸イソメラーゼ） のようにタグなしでニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） 樹脂に結合する宿主タンパク質が混じるため、実務ではIMACのあとにイオン交換やゲル濾過 gel filtration ゲル濾過（gel filtration） gel filtration（ゲル濾過） を重ねる。
• 細胞溶解cytolysis 細胞溶解（cytolysis）cytolysis（細胞溶解） （リゾチームlysozymeリゾチーム（lysozyme）lysozyme（リゾチーム）・DNase・リン酸緩衝液）により細菌細胞 bacteria 細菌細胞（bacteria） bacteria（細菌細胞） を破壊し遠心分離 centrifugation 遠心分離（centrifugation） centrifugation（遠心分離） で上清 supernatant 上清（supernatant） supernatant（上清） に可溶性タンパク質を得た後、ヒスチジンhistidine ヒスチジン（histidine）histidine（ヒスチジン） 残基とニッケル nickel ニッケル（nickel） nickel（ニッケル） イオンの配位結合 coordinate bond 配位結合（coordinate bond） coordinate bond（配位結合） を利用したアフィニティークロマトグラフィー affinity chromatography アフィニティークロマトグラフィー（affinity chromatography） affinity chromatography（アフィニティークロマトグラフィー） で標的タンパク質を樹脂に結合させる。DNaseが分解するのはDNAだけで、粘度低下は放出された染色体DNAの切断による。樹脂側ではNi²⁺が四座配位子 ligand 配位子（ligand） ligand（配位子） NTAに保持され、残る2つの配位座 coordination site 配位座（coordination site） coordination site（配位座） がHisタグとの結合に使われる。
• 洗浄（低濃度イミダゾール imidazoleイミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール）、20mM）では非特異的結合 aspecific binding 非特異的結合（aspecific binding） aspecific binding（非特異的結合） タンパク質のみが除去され、溶出（高濃度イミダゾール imidazoleイミダゾール（imidazole） imidazole（イミダゾール）、500mM）では濃度差 concentration difference 濃度差（concentration difference） concentration difference（濃度差） により6×Hisタグ付き標的タンパク質自体が競合的 competitive 競合的（competitive） competitive（競合的） に追い出されて回収される。