原核生物における遺伝子発現の解析：大腸菌でのβ-ガラクトシダーゼの誘導

🧠 lacオペロンは4通りの入力（グルコース・ラクトースの有無）を1つの出力（オペロンON/OFF）へ変換する論理ゲートであり、その回路は「リプレッサーが常にオペレーター operator オペレーター（operator） operator（オペレーター） を塞いでいる」というデフォルトOFFの状態から出発する。 ラクトースの存在だけがリプレッサーを外し、グルコースの不在だけがCRP（CAP）を活性化してRNARNA（ribonucleic acid）ポリメラーゼの結合を強化する——両方が揃って初めて「ON」になるANDゲートである。実験ではこのオペロンの働きをIPTG（分解されない誘導物質）とONPG（発色する人工基質）という2つの「トリック分子」で可視化し、リファンピシン（転写阻害）とクロラムフェニコールchloramphenicolクロラムフェニコール（chloramphenicol）chloramphenicol（クロラムフェニコール）（翻訳阻害typical翻訳阻害（typical）typical（翻訳阻害））という異なる標的を持つ2種の抗生物質 antibiotics 抗生物質（antibiotics） antibiotics（抗生物質） で、誘導のどの段階が阻害されているかを切り分ける。

プロモーターの強弱

強いプロモーター： 開始が毎時間起こる——コンセンサス配列が変化しておらず（進化的に）保存されているため。σ因子への親和性が高い＝RNAポリメラーゼの結合頻度が高い。

弱いプロモーター： 開始が週/月に1度起こる——コンセンサス配列が変化しているため。σ因子への親和性が低い＝結合頻度が低い。

構成的遺伝子と誘導性遺伝子

構成的遺伝子constitutive genes 構成的遺伝子（constitutive genes）constitutive genes（構成的遺伝子） ： ハウスキーピング遺伝子housekeeping gene ハウスキーピング遺伝子（housekeeping gene）housekeeping gene（ハウスキーピング遺伝子） であり、常にONになっている。タンパク質は細胞により継続的に産生される。

誘導性遺伝子inducible gene 誘導性遺伝子（inducible gene）inducible gene（誘導性遺伝子） ： 常に活性であるわけではない。その働きは環境条件や外部刺激に依存し、これらは人工的に制御できる＝ON/OFFに切り替えられる。

→ リプレッサーまたはアクチベータータンパク質が特異的DNADNA（deoxyribonucleic acid）配列を認識・結合し、近傍遺伝子の転写を制御する。

lacオペロン——負の誘導性調節

• ラクトース（二糖disaccharide 二糖（disaccharide）disaccharide（二糖） ：ガラクトース galactose ガラクトース（galactose） galactose（ガラクトース） ＋グルコース）の分解に必要な3つのタンパク質をコードする調節遺伝子 regulator gene 調節遺伝子（regulator gene） regulator gene（調節遺伝子） の配列である
• ヒトの消化管内の大腸菌に見出され、酵素β-ガラクトシダーゼを産生する——これによりラクトースを分解できるようになる
• タンパク質のコード配列 coding sequence コード配列（coding sequence） coding sequence（コード配列） ：LacZ（β-ガラクトシダーゼ）、LacY（ラクトースパーミアーゼ permease パーミアーゼ（permease） permease（パーミアーゼ） ＝β-ガラクトシドパーミアーゼ galactosidase permeaseガラクトシドパーミアーゼ（galactosidase permease） galactosidase permease（ガラクトシドパーミアーゼ））、LacA（ガラクトシドトランスアセチラーゼgalactoside transacetylaseガラクトシドトランスアセチラーゼ（galactoside transacetylase）galactoside transacetylase（ガラクトシドトランスアセチラーゼ））
  • LacI遺伝子はlacオペロンのリプレッサーを作る構成的遺伝子 constitutive genes 構成的遺伝子（constitutive genes） constitutive genes（構成的遺伝子） である——オペロン自体の一部ではない

⚠️ LacYは「ガラクトシダーゼgalactosidase ガラクトシダーゼ（galactosidase）galactosidase（ガラクトシダーゼ） パーミアーゼ permeaseパーミアーゼ（permease） permease（パーミアーゼ）」ではなくラクトース（β-ガラクトシド）パーミアーゼ permease パーミアーゼ（permease） permease（パーミアーゼ） である。 分解酵素ではなく輸送体で、ガラクトシドとH⁺を同じ向きに運ぶシンポーター symporter シンポーター（symporter） symporter（シンポーター） として働き、外のラクトースを細胞内へ取り込む。6本ずつの膜貫通ヘリックスからなる2つのドメインが擬対称に向かい合い、その中央の親水性 hydrophilic 親水性（hydrophilic） hydrophilic（親水性） 空洞に糖が結合する¹。LacZが「切る」役、LacYが「入れる」役である。

このオペロンは通常OFFである——グルコース存在下では、大腸菌はラクトースを消化するこれらのタンパク質を産生するためにエネルギーと時間を無駄にしたくないためである。グルコース不在下（例：飢餓状態 starvation飢餓状態（starvation） starvation（飢餓状態））では、ラクトースを分解できるこれらのタンパク質を産生する必要がある。したがってラクトースはグルコースの代替であり、細胞が別のエネルギー源を必要とする場合にのみ分解される。

大腸菌は酵素β-ガラクトシダーゼを産生でき、これが二糖 disaccharide 二糖（disaccharide） disaccharide（二糖） ラクトースを2つの単糖 monosaccharide 単糖（monosaccharide） monosaccharide（単糖） 成分——グルコースとガラクトース galactose ガラクトース（galactose） galactose（ガラクトース） ——への加水分解を触媒する。単糖monosaccharide 単糖（monosaccharide）monosaccharide（単糖） はその後細菌により容易に代謝されうる。

lacオペロンの機能

常に： リプレッサー四量体 tetramer 四量体（tetramer） tetramer（四量体） タンパク質がオペレーター operator オペレーター（operator） operator（オペレーター） に結合している＝転写なし。RNAポリメラーゼの結合はcAMP活性化型CRP（CAP）二量体により増強される。Lacリプレッサーの二量体の二量体の存在が転写を妨げる。

• 条件1： ラクトースが存在しない→lacリプレッサーがlacオペレーター operator オペレーター（operator） operator（オペレーター） に結合し、これは転写部位と重なる＋CAPは結合していない
• 条件4： ラクトースのみが存在する→誘導物質がリプレッサータンパク質に結合する→コンフォメーション変化 conformational change コンフォメーション変化（conformational change） conformational change（コンフォメーション変化） がリプレッサーをオペロンから解離させる。cAMPcAMP（cyclic adenosine monophosphate）-CAP複合体もまた転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 頻度を大幅に増加させる→活性化により高レベルのlac mRNAの合成がもたらされる

⚠️ リプレッサーを外す「誘導物質」はラクトースそのものではなく、アロラクトースである。 β-ガラクトシダーゼは取り込まれたラクトースの大半をグルコース＋ガラクトース galactose ガラクトース（galactose） galactose（ガラクトース） へ加水分解するが、副反応としてグルコースをアクセプター acceptor アクセプター（acceptor） acceptor（アクセプター） に受け直し、結合位置をβ1→4からβ1→6へ組み替えた異性体 isomer異性体（isomer） isomer（異性体）アロラクトースを作る²。lacリプレッサーに結合して構造変化 conformational change 構造変化（conformational change） conformational change（構造変化） を起こすのはこのアロラクトースであって、ラクトース分子そのものではない³。

💡 だからlacオペロンは「完全にOFF」ではありえない。 アロラクトースを作るにはβ-ガラクトシダーゼが、そもそもラクトースを細胞内へ入れるにはLacYパーミアーゼ permease パーミアーゼ（permease） permease（パーミアーゼ） が、誘導前から少量存在していなければならない。抑制状態でもオペロンから微量の転写が漏れている（基底発現）ことが誘導開始の前提になっており、「誘導物質が入る→酵素が増える→誘導物質がもっと作られる」という正のフィードバックが、生理的なラクトース濃度と増殖速度の範囲でlacオペロンに双安定なスイッチ的挙動を与える³。

flowchart TD
  A["グルコース(+)・ラクトース(-)"] --> B["リプレッサー結合・CAP非結合→OFF"]
  C["グルコース(-)・ラクトース(-)"] --> D["リプレッサー結合→OFF"]
  E["グルコース(+)・ラクトース(+)"] --> F["リプレッサー解離もCAP非結合→非常に低い発現・OFF"]
  G["グルコース(-)・ラクトース(+)"] --> H["リプレッサー解離＋<span class='jp-term jp-term-diagram' title='cyclic adenosine monophosphate'>cAMP</span>-CAP結合→ON・高発現"]

実験

IPTG（イソプロピルisopropyl イソプロピル（isopropyl）isopropyl（イソプロピル） β-D-1-チオガラクトピラノシド）はラクトース様分子であり、lacリプレッサーに対しラクトース自体と同じ効果を持つ。ラクトースに対する利点は、β-ガラクトシダーゼにより分解されないため、その濃度が一定に保たれる点である。より正確には、IPTGが真似ているのは天然の誘導物質アロラクトースの側であり、分解されない理由は、糖とアグリコンをつなぐグリコシド酸素がイオウに置き換わったチオ配糖体 glycoside配糖体（glycoside） glycoside（配糖体）だからである（β-ガラクトシダーゼはグリコシド酸素の側を切るので、S-グリコシド結合 glycosidic bond グリコシド結合（glycosidic bond） glycosidic bond（グリコシド結合） には手が出ない）。おかげで「誘導物質が消費されて誘導が尻すぼみになる」ことも「誘導物質自体が炭素源として代謝される」こともなく、誘導の強さを実験者が固定できる。

β-ガラクトシダーゼはその酵素活性に基づいて検出できる。決定には合成基質 synthetic substrate合成基質（synthetic substrate） synthetic substrate（合成基質）ONPG（オルトortho オルト（ortho）ortho（オルト） -ニトロフェニル nitrophenyl ニトロフェニル（nitrophenyl） nitrophenyl（ニトロフェニル） -β-D-ガラクトピラノシド）——ラクトース様分子——を用いることができる。

β-ガラクトシダーゼはONPGをガラクトース galactose ガラクトース（galactose） galactose（ガラクトース） とオルト ortho オルト（ortho） ortho（オルト） -ニトロフェノール phenol フェノール（phenol） phenol（フェノール） へ加水分解する。オルトortho オルト（ortho）ortho（オルト） -ニトロフェノール phenol フェノール（phenol） phenol（フェノール） は黄色を呈し、分光光度法により定量できる。

⚠️ ONPGの「G」はガラクトシダーゼ galactosidase ガラクトシダーゼ（galactosidase） galactosidase（ガラクトシダーゼ） ではなくガラクトピラノシドである。 ONPGは酵素ではなく基質、すなわちo-ニトロフェノール phenol フェノール（phenol） phenol（フェノール） にβ-D-ガラクトース galactose ガラクトース（galactose） galactose（ガラクトース） がグリコシド結合 glycosidic bond グリコシド結合（glycosidic bond） glycosidic bond（グリコシド結合） した配糖体 glycoside 配糖体（glycoside） glycoside（配糖体） である。IPTGと骨格は同じで、アグリコンがイソプロピル isopropyl イソプロピル（isopropyl） isopropyl（イソプロピル） 基か o-ニトロフェニル nitrophenyl ニトロフェニル（nitrophenyl） nitrophenyl（ニトロフェニル） 基か、そして結合が S か O かだけが違う——O結合のONPGは切られて発色し、S結合のIPTGは切られずに誘導だけをするという役割分担がここから出てくる。

酵素誘導enzyme induction 酵素誘導（enzyme induction）enzyme induction（酵素誘導） の過程は3段階に分けられる：

1. 誘導物質によるリプレッサーの不活性化
2. mRNA合成
3. mRNAのタンパク質への翻訳

細菌におけるβ-ガラクトシダーゼ発現への各種抗生物質の効果

誘導は上記のいずれの段階でも阻害されうる。2種類の阻害剤 inhibitor 阻害剤（inhibitor） inhibitor（阻害剤） を区別する：

• リファンピシン： 細菌RNAポリメラーゼの阻害剤 inhibitor 阻害剤（inhibitor） inhibitor（阻害剤） →転写を妨げる
• クロラムフェニコールchloramphenicol クロラムフェニコール（chloramphenicol）chloramphenicol（クロラムフェニコール） ： 細菌リボソームbacterial ribosomes 細菌リボソーム（bacterial ribosomes）bacterial ribosomes（細菌リボソーム） を直接阻害する→翻訳を妨げる

flowchart TD
  A["DNA"] -->|"転写（リファンピシンで阻害）"| B["mRNA"]
  B -->|"リボソームでの翻訳（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='chloramphenicol'>クロラムフェニコール</span>で阻害）"| C["ポリペプチド鎖"]
  C -->|"組み立て"| D["タンパク質（β-ガラクトシダーゼ）"]

まとめ

• lacオペロンは負の誘導性 inducibility 誘導性（inducibility） inducibility（誘導性） 調節の代表例であり、通常はリプレッサー（LacI遺伝子産物）がオペレーター operator オペレーター（operator） operator（オペレーター） に結合しOFF状態にある。リプレッサーを外す誘導物質はラクトースそのものではなく、β-ガラクトシダーゼが副反応で作る異性体 isomer 異性体（isomer） isomer（異性体） アロラクトースであり、LacYはラクトース（β-ガラクトシド）パーミアーゼ permease パーミアーゼ（permease） permease（パーミアーゼ） ＝取り込み用のシンポーター symporter シンポーター（symporter） symporter（シンポーター） である。グルコースが存在しラクトースが存在しない場合を含む3つの条件ではオペロンはOFFのままだが、グルコース不在かつラクトース存在の条件でのみリプレッサーの解離とcAMP-CAP複合体による転写促進 transcriptional activation 転写促進（transcriptional activation） transcriptional activation（転写促進） が重なりONになる。
• 実験ではIPTG（イソプロピルisopropyl イソプロピル（isopropyl）isopropyl（イソプロピル） β-D-1-チオガラクトピラノシド。S結合のため分解されないアロラクトース類似体）を用いてリプレッサーを不活性化し、合成基質synthetic substrate 合成基質（synthetic substrate）synthetic substrate（合成基質） ONPG（オルトortho オルト（ortho）ortho（オルト） -ニトロフェニル nitrophenyl ニトロフェニル（nitrophenyl） nitrophenyl（ニトロフェニル） -β-D-ガラクトピラノシド。O結合なので切られる）のβ-ガラクトシダーゼによる加水分解で生じるo-ニトロフェノール phenol フェノール（phenol） phenol（フェノール） の黄色を分光光度法で測定することで酵素誘導 enzyme induction 酵素誘導（enzyme induction） enzyme induction（酵素誘導） を定量する。
• リファンピシン（RNAポリメラーゼ阻害→転写阻害）とクロラムフェニコール chloramphenicol クロラムフェニコール（chloramphenicol） chloramphenicol（クロラムフェニコール） （リボソーム阻害→翻訳阻害 typical翻訳阻害（typical） typical（翻訳阻害））は、誘導過程のどの段階が阻害されているかを区別するために用いられる。