分子生物学におけるin silicoツール

🧠 この単元は「遺伝的多様性の分類」と「その分類を実際に検証するin silicoワークフロー」という2つの層からなる。 分類の軸は2つ——単一遺伝子か多数の遺伝子・環境要因が絡むか（単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患） vs 多因子疾患polygenic, complex/multifactorial disease多因子疾患（polygenic, complex/multifactorial disease）polygenic, complex/multifactorial disease（多因子疾患））、そして塩基配列の変化が「置換」か「長さの変化」か（SNV vs 長さ多型）。そして後半のPTC苦味 bitter taste 苦味（bitter taste） bitter taste（苦味） 受容体の実験は、この分類論を実地に動かす実演であり、OMIM→NCBI→NEBcutter→Primer-BLASTという4つのデータベース/ツールを順に通すことで、「遺伝子を知る→配列を知る→制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） 部位を知る→プライマーを設計する」という一直線のin silicoパイプラインを体現している。

in silico手法とは

in silico手法とは、コンピュータベースの探索を介して行われる手法を指す。この手法には以下が含まれる：

• コンピュータ化されたデータベースでの検索
• コンピュータベースの設計
• 化学的・生化学的反応のモデリングとシミュレーション
• シグナル伝達、細胞の成長・分裂・分化を統括する分子ネットワークなどの生体内 in vivo 生体内（in vivo） in vivo（生体内） 細胞過程

💡 「モデリングとシミュレーション」の中身は2021年に大きく入れ替わった。 蛋白質の立体構造 conformational 立体構造（conformational） conformational（立体構造） 予測は長らく相同構造がある場合に限られていたが、AlphaFoldがCASP14（2020年の第14回蛋白質構造予測評価）で、相同構造が既知でない場合でも実験構造に匹敵する原子レベルの精度を達成した¹。予測結果はAlphaFold DBとして公開され、2021年の30万構造から2024年には2億1,400万超の配列をカバーするまで拡大し、PDB・UniProt・Ensembl・InterProといった一次データ資源に統合されている²。in silicoツールの一覧を覚えるときは、配列データベース（NCBI・Ensembl・UniProt）と構造リソース（PDB・AlphaFold DB）を別の層として押さえる。

→ これらを総合すると、in silico手法は医療実践だけでなく基礎/応用生物医学研究の両方にとって不可欠なものとなっている。

遺伝的変異と疾患の分類

一般的な個体差 individual variation 個体差（individual variation） individual variation（個体差） は主に遺伝的変異 genetic variation 遺伝的変異（genetic variation） genetic variation（遺伝的変異） ——すなわちヒトゲノムにおける多型と変異——に起因する。形質や疾患はこれら個体間の遺伝的変異 genetic variation 遺伝的変異（genetic variation） genetic variation（遺伝的変異） に帰せられる：

変異の型：SNVと長さ多型

SNV（single nucleotide variation、単一ヌクレオチド変異）： ゲノム中の1つのヌクレオチドが変化すること

• SNP（single nucleotide polymorphism、一塩基多型single-nucleotide polymorphisms, SNP一塩基多型（single-nucleotide polymorphisms, SNP）single-nucleotide polymorphisms, SNP（一塩基多型））： 集団の1%超に見られる
• 点変異（置換。広義には1〜数塩基の欠失・挿入を含めることもある）：集団の1%未満に見られる

💡 SNVは厳密には「1塩基の置換」を指す。 上の括弧に欠失・挿入が入っているのは広義の用法で、このノートのまとめでもSNV＝塩基置換として整理している。1〜数塩基の欠失・挿入（indel）は塩基数が変わるため、読み枠reading frame 読み枠（reading frame）reading frame（読み枠） のずれ（フレームシフトframeshiftフレームシフト（frameshift）frameshift（フレームシフト））を起こしうる点で置換とは効果が本質的に異なり、下の「長さ多型」側の論理で考える。

⚠️ 「頻度1%を境に多型か変異か」という線引きは、現在の臨床遺伝学の用語法ではない。 分類の由来としては有用だが、ACMG（米国臨床遺伝・ゲノム学会）とAMP（分子病理molecular pathology 分子病理（molecular pathology）molecular pathology（分子病理） 学会）は2015年の合同ガイドラインで、配列変化を pathogenic（病的）／likely pathogenic／uncertain significance（意義不明、VUS）／likely benign／benign の5段階で分類する標準用語を推奨し、集団頻度は計算予測・機能解析・家系内分離と並ぶ証拠の1つに位置づけ直した³。詳細は分子細胞生物学04・10で扱う。

長さ多型：（長さが異なる）

• マイクロサテライトmicrosatellite マイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト） （短鎖縦列反復short tandem repeat (STR)短鎖縦列反復（short tandem repeat (STR)）short tandem repeat (STR)（短鎖縦列反復）、2〜10bp）
• ミニサテライトminisatellite ミニサテライト（minisatellite）minisatellite（ミニサテライト） （可変数 variables 変数（variables） variables（変数） 縦列反復＝VNTR、10〜1000bp）

💡 マイクロサテライトmicrosatellite マイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト） には1塩基単位の反復も含まれる。 上の「2〜10bp」は反復単位 repeating unit 反復単位（repeating unit） repeating unit（反復単位） 長のよくある目安だが、臨床で最も使われるマイクロサテライト microsatellite マイクロサテライト（microsatellite） microsatellite（マイクロサテライト） は単塩基反復である——マイクロサテライト不安定性 microsatellite instability, MSI マイクロサテライト不安定性（microsatellite instability, MSI） microsatellite instability, MSI（マイクロサテライト不安定性） （MSI）判定の国際コンセンサス参照パネルは2つの単塩基反復（BAT-25、BAT-26）と3つの2塩基反復から成り、単塩基反復5個によるpentaplex PCRPCR（polymerase chain reaction）は感度・特異度100%でMSI腫瘍を判定できた⁴。

💡 コーディング領域内でのSNP/点変異の効果には様々な段階がありうる——61のコドンが20種のアミノ酸を指定するため「何も変化しない（同義置換synonymous同義置換（synonymous）synonymous（同義置換））」場合もあれば、アミノ酸1つの変化、誤ったスプライシング、「ナンセンスnonsense (mutation)ナンセンス（nonsense (mutation)）nonsense (mutation)（ナンセンス）」変異（アミノ酸→終止コドン stop codon終止コドン（stop codon） stop codon（終止コドン）、タンパク質末端の欠損）が生じることもある。長さ変異では、塩基対base pairing 塩基対（base pairing）base pairing（塩基対） 数が3nならnアミノ酸分の変化にとどまるが、3n+1または3n+2であれば「フレームシフトframeshiftフレームシフト（frameshift）frameshift（フレームシフト）」変異となり下流全体が読み枠 reading frame 読み枠（reading frame） reading frame（読み枠） のずれによって破綻する（分子細胞生物学 10：点突然変異の種類と発生機序参照）。

実験：TAS2R38苦味受容体のPTC感受性SNPの遺伝子型判定

実験の目的は、天然に存在する化合物であるフェニルチオカルバミド phenylthiocarbamide (PTC) フェニルチオカルバミド（phenylthiocarbamide (PTC)） phenylthiocarbamide (PTC)（フェニルチオカルバミド） の苦味 bitter taste 苦味（bitter taste） bitter taste（苦味） 感受性に決定的に関与する自身のSNPを遺伝子型判定 genotyping 遺伝子型判定（genotyping） genotyping（遺伝子型判定） することである。TAS2R38遺伝子は苦味 bitter taste 苦味（bitter taste） bitter taste（苦味） 感受性に決定的な3つのSNPを持つ。

in silico手法の利用

• OMIM（Online Mendelian Inheritance in Man）は、PTCに感受性の遺伝子（TAS2R38）を見つけることができるデータベースである
• NCBIヌクレオチドデータベースも用いて、両ハプロタイプ haplotype ハプロタイプ（haplotype） haplotype（ハプロタイプ） によりコードされるアミノ酸配列 amino-acid sequence アミノ酸配列（amino-acid sequence） amino-acid sequence（アミノ酸配列） を決定する
• SNPを含むゲノム配列はポリメラーゼ連鎖反応 polymerase chain reaction, PCR ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR） polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応） により増幅される
• PCR-RFLPによりSNPを解析する→NEBcutterにより適切な制限エンドヌクレアーゼ endonuclease エンドヌクレアーゼ（endonuclease） endonuclease（エンドヌクレアーゼ） を選択する→NCBI Primer-BLASTによりフォワード・リバースプライマーを設計する

💡 NEBcutterの現行版はV3.0である。 入力配列を切断する制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） を網羅的に報告するツールで、認識部位の表は制限酵素 restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease） restriction endonuclease（制限酵素） データベースREBASEから毎日更新され、DamやDcmなどのメチル化の影響を受ける部位に印が付く⁵。実習資料が指す旧V2.0（nc2.neb.com）は現在 nc3.neb.com のV3.0へ転送される⁶。OMIM・NCBI Gene／dbSNP・Primer-BLASTはいずれも同じ名称・同じ位置づけで現在も稼働している。

実験の段階

1. セッション1：in silico設計
   1. 形質（PTC感受性）→OMIMデータベース
   2. 遺伝子→NCBI gene、dbSNP
   3. RFLP→NEBcutter
   4. PCR→NCBI Primer-BLAST
2. セッション2： PTCの味わい（「表現型判定」）、DNADNA（deoxyribonucleic acid）単離とPCR
3. セッション3： PCR産物の消化、ゲル電気泳動gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動） →「遺伝子型判定genotyping遺伝子型判定（genotyping）genotyping（遺伝子型判定）」

flowchart TD
  A["形質（PTC感受性）を確認"] --> B["OMIMデータベースで<span class='jp-term jp-term-diagram' title='causative gene'>原因遺伝子</span>を検索（TAS2R38）"]
  B --> C["NCBI gene/dbSNPでSNPの位置と配列を確認"]
  C --> D["NEBcutterで適切な<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>を選択（RFLP用）"]
  D --> E["NCBI Primer-BLASTでフォワード/リバースプライマーを設計"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='polymerase chain reaction'>PCR</span>によるゲノム配列の増幅"]
  F --> G["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='restriction endonuclease'>制限酵素</span>消化→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='gel electrophoresis'>ゲル電気泳動</span>による<span class='jp-term jp-term-diagram' title='genotyping'>遺伝子型判定</span>"]

まず、対象のSNPを包含するゲノム配列をポリメラーゼ連鎖反応 polymerase chain reaction, PCR ポリメラーゼ連鎖反応（polymerase chain reaction, PCR） polymerase chain reaction, PCR（ポリメラーゼ連鎖反応） により増幅する→その後アンプリコン amplicon アンプリコン（amplicon） amplicon（アンプリコン） を適切な制限エンドヌクレアーゼ endonuclease エンドヌクレアーゼ（endonuclease） endonuclease（エンドヌクレアーゼ） で配列特異的に切断する→その後消化断片をアガロース agarose アガロース（agarose） agarose（アガロース） ゲル電気泳動 gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis） gel electrophoresis（ゲル電気泳動） により分離する（詳細は78-genotyping-of-the-tas2r38-tasting-receptor-by-pcr-rflp参照）。

まとめ

• 遺伝的多様性は単一遺伝子疾患 monogenic disease 単一遺伝子疾患（monogenic disease） monogenic disease（単一遺伝子疾患） （1遺伝子座→1形質）と多因子疾患 polygenic, complex/multifactorial disease 多因子疾患（polygenic, complex/multifactorial disease） polygenic, complex/multifactorial disease（多因子疾患） （多数の遺伝子変異＋環境要因）に分類され、変異の型はSNV（SNP・点変異、塩基置換）と長さ多型（マイクロサテライトmicrosatelliteマイクロサテライト（microsatellite）microsatellite（マイクロサテライト）・ミニサテライトminisatelliteミニサテライト（minisatellite）minisatellite（ミニサテライト））に分けられる。ただし「頻度1%を境に多型／変異」という線引きは臨床では用いられず、2015年のACMG/AMPガイドライン以降はpathogenic〜benignの5段階分類が標準用語である。
• in silico手法（データベース検索、コンピュータベースの設計、モデリング/シミュレーション）は医療実践と生物医学研究の両方に不可欠であり、TAS2R38の苦味 bitter taste 苦味（bitter taste） bitter taste（苦味） 感受性SNPの遺伝子型判定 genotyping 遺伝子型判定（genotyping） genotyping（遺伝子型判定） 実験はこれを具体的に実演する。
• 実験はOMIM（遺伝子の同定）→NCBI gene/dbSNP（配列確認）→NEBcutter（制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） 選択）→NCBI Primer-BLAST（プライマー設計）という一連のin silicoツールを経て、PCR増幅・制限酵素restriction endonuclease 制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素） 消化・ゲル電気泳動gel electrophoresis ゲル電気泳動（gel electrophoresis）gel electrophoresis（ゲル電気泳動） による実際の遺伝子型判定 genotyping 遺伝子型判定（genotyping） genotyping（遺伝子型判定） へとつながる。