Biochemistry · 5/10
血漿中トリグリセリドとコレステロールの測定
Determination of triglycerides and cholesterol in blood plasma — P I
🧠 血漿脂質測定plasma lipid assay血漿脂質測定（plasma lipid assay）plasma lipid assay（血漿脂質測定）は「特異的酵素specific enzyme特異的酵素（specific enzyme）specific enzyme（特異的酵素）で最終的にH₂O₂を作り、ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）で発色させる」という共通パターンで読む。 コレステロール測定はエステラーゼ→オキシダーゼ→ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）の3段階酵素反応、トリグリセリド測定はリパーゼ→グリセロールキナーゼglycerol kinaseグリセロールキナーゼ（glycerol kinase）glycerol kinase（グリセロールキナーゼ）→G3Pオキシダーゼ→ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）の4段階酵素反応。HDLコレステロールhigh-density lipoprotein cholesterolHDLコレステロール（high-density lipoprotein cholesterol）high-density lipoprotein cholesterol（HDLコレステロール）は沈殿法precipitation method沈殿法（precipitation method）precipitation method（沈殿法）でVLDL/LDLを除いてから測定する。
血漿脂質とリポタンパクの基礎
血漿脂質濃度plasma lipid concentration血漿脂質濃度（plasma lipid concentration）plasma lipid concentration（血漿脂質濃度）は約500–600 mg/100 mLで、特異的タンパクspecific protein特異的タンパク（specific protein）specific protein（特異的タンパク）と強く結合している。リポタンパクは電気泳動的性質electrophoretic mobility電気泳動的性質（electrophoretic mobility）electrophoretic mobility（電気泳動的性質）でHDL・プレβ（VLDL）・β（LDL）リポタンパクとカイロミクロンchylomicronカイロミクロン（chylomicron）chylomicron（カイロミクロン）に分類される。
- 脂質成分lipid components脂質成分（lipid components）lipid components（脂質成分）：①コレステロール（総量の約70%は不飽和脂肪酸unsaturated fatty acid不飽和脂肪酸（unsaturated fatty acid）unsaturated fatty acid（不飽和脂肪酸）でエステル化esterificationエステル化（esterification）esterification（エステル化））、②トリアシルグリセロールtriacylglycerol, TAGトリアシルグリセロール（triacylglycerol, TAG）triacylglycerol, TAG（トリアシルグリセロール）（triacylglycerol、TAG）、③リン脂質。
- リポタンパクの構造：疎水性コアcore疎水性コア（core）core（疎水性コア）（hydrophobic core、TAG・コレステロールエステルcholesteryl esterコレステロールエステル（cholesteryl ester）cholesteryl ester（コレステロールエステル））を、極性脂質polar lipid極性脂質（polar lipid）polar lipid（極性脂質）とアポリポタンパクapolipoproteinアポリポタンパク（apolipoprotein）apolipoprotein（アポリポタンパク）の層が包む。
- リポタンパクの2大機能：①脂質の可溶化solubilization可溶化（solubilization）solubilization（可溶化）、②標的組織target tissue標的組織（target tissue）target tissue（標的組織）への脂質輸送lipid transport脂質輸送（lipid transport）lipid transport（脂質輸送）の調節。
💡 コレステロールの半分は合成、半分は食事由来。 体内コレステロールの約半分は内因性合成endogenous synthesis内因性合成（endogenous synthesis）endogenous synthesis（内因性合成）、残り半分が食事吸収dietary absorption食事吸収（dietary absorption）dietary absorption（食事吸収）による。一部は胆汁中に排泄され、胆汁酸への変換が脂質の可溶化solubilization可溶化（solubilization）solubilization（可溶化）・消化を助ける。LDLによるコレステロールの組織への輸送は、細胞膜形成plasma membrane formation細胞膜形成（plasma membrane formation）plasma membrane formation（細胞膜形成）とステロイドホルモン生合成steroid hormone biosynthesisステロイドホルモン生合成（steroid hormone biosynthesis）steroid hormone biosynthesis（ステロイドホルモン生合成）に重要な役割を果たす。
脂質と動脈硬化の臨床的背景
- 動脈閉塞患者patients with arterial occlusion動脈閉塞患者（patients with arterial occlusion）patients with arterial occlusion（動脈閉塞患者）の約70%で高リポタンパク血症Hyperlipoproteinemia高リポタンパク血症（Hyperlipoproteinemia）Hyperlipoproteinemia（高リポタンパク血症）を認める。
- 動脈壁結合組織arterial wall connective tissue動脈壁結合組織（arterial wall connective tissue）arterial wall connective tissue（動脈壁結合組織）に沈着する脂質は血漿リポタンパク由来であることが示されている。
- 原発性高リポタンパク血症primary hyperlipoproteinemia原発性高リポタンパク血症（primary hyperlipoproteinemia）primary hyperlipoproteinemia（原発性高リポタンパク血症）患者の約70%が冠動脈硬化coronary atherosclerosis冠動脈硬化（coronary atherosclerosis）coronary atherosclerosis（冠動脈硬化）・心筋梗塞を合併する。
- 高リポタンパク血症Hyperlipoproteinemia高リポタンパク血症（Hyperlipoproteinemia）Hyperlipoproteinemia（高リポタンパク血症）治療で血漿脂質濃度plasma lipid concentration血漿脂質濃度（plasma lipid concentration）plasma lipid concentration（血漿脂質濃度）が下がると、心筋梗塞の頻度も低下する相関がある。
- 心筋梗塞で死亡した患者の60%（コレステロール200–300 mg/dL）・25%（>300 mg/dL）で、それぞれの範囲のコレステロール値が確認されている。
コレステロール測定の原理
コレステロールエステルcholesteryl esterコレステロールエステル（cholesteryl ester）cholesteryl ester（コレステロールエステル）をコレステロールエステラーゼcholesterol esteraseコレステロールエステラーゼ（cholesterol esterase）cholesterol esterase（コレステロールエステラーゼ）で加水分解し、遊離コレステロールfree cholesterol遊離コレステロール（free cholesterol）free cholesterol（遊離コレステロール）をコレステロールオキシダーゼで酸化、生じたH₂O₂をペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）共役反応で発色させる。
flowchart TD
A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='cholesteryl ester'>コレステロールエステル</span>"]
A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='cholesterol esterase'>コレステロールエステラーゼ</span> → コレステロール + 脂肪酸"]
B --> C["コレステロールオキシダーゼ → コレスト-4-エン-3-オン + H₂O₂"]
C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='peroxidase'>ペルオキシダーゼ</span>：H₂O₂ + <span class='jp-term jp-term-diagram' title='phenol'>フェノール</span> + <span class='jp-term jp-term-diagram' title='4-aminoantipyrine'>4-アミノアンチピリン</span><br>→ <span class='jp-term jp-term-diagram' title='quinone'>キノン</span>イミン（赤色）+ 2 H₂O"]
D --> E["505 nm付近の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span> ∝ <span class='jp-term jp-term-diagram' title='total cholesterol'>総コレステロール</span>濃度"]| 試薬 | 内容 |
|---|---|
| Reagent#1 | 50 mmol/L PIPES緩衝液（pH 6.9）＋24 mmol/L フェノールphenolフェノール（phenol）phenol（フェノール） |
| Reagent#2 | コレステロールエステラーゼcholesterol esteraseコレステロールエステラーゼ（cholesterol esterase）cholesterol esterase（コレステロールエステラーゼ）250 U/L、コレステロールオキシダーゼ250 U/L、ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）1000 U/L、4-アミノアンチピリン4-aminoantipyrine4-アミノアンチピリン（4-aminoantipyrine）4-aminoantipyrine（4-アミノアンチピリン）0.5 mmol/L、NaCl 2.5 mmol/L |
HDLコレステロールの分別測定
VLDL・LDL画分は、Ca²⁺/Mg²⁺/Mn²⁺イオン＋（硫酸化sulfation硫酸化（sulfation）sulfation（硫酸化））ポリアニオンpolyanionポリアニオン（polyanion）polyanion（ポリアニオン）の存在下で選択的に沈殿precipitation沈殿（precipitation）precipitation（沈殿）する。遠心centrifugation遠心（centrifugation）centrifugation（遠心）後、上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）（HDL画分のみ残る）に対して同じ酵素法でコレステロール濃度を測定すればHDL-コレステロールが求まる。
トリグリセリド測定の原理
トリグリセリドをリポタンパクリパーゼlipoprotein lipase (LPL)リポタンパクリパーゼ（lipoprotein lipase (LPL)）lipoprotein lipase (LPL)（リポタンパクリパーゼ）で加水分解し、遊離したグリセロールをグリセロールキナーゼglycerol kinaseグリセロールキナーゼ（glycerol kinase）glycerol kinase（グリセロールキナーゼ）・G3Pオキシダーゼで酸化してH₂O₂を生成、同様にペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）発色で定量する。
flowchart TD
A["トリグリセリド"]
A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='lipoprotein lipase (LPL)'>リポタンパクリパーゼ</span> → グリセロール + 脂肪酸"]
B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='glycerol kinase'>グリセロールキナーゼ</span>（ATP、Mg²⁺）→ グリセロール-3-リン酸 + ADP"]
C --> D["グリセロール-3-リン酸オキシダーゼ → ジヒドロキシアセトンリン酸 + H₂O₂"]
D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='peroxidase'>ペルオキシダーゼ</span>：H₂O₂ + <span class='jp-term jp-term-diagram' title='4-aminoantipyrine'>4-アミノアンチピリン</span> + ESPAS<br>→ 赤色誘導体"]
E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='absorbance'>吸光度</span> ∝ トリグリセリド濃度"]💡 両アッセイとも「最終ステップfinal step最終ステップ（final step）final step（最終ステップ）は同じ」。 コレステロール・トリグリセリドいずれの測定も、最終的にH₂O₂を発生させ、ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）共役反応で発色させる点は共通。特異性は上流の酵素（エステラーゼ／リパーゼ、オキシダーゼの種類）が担う。
実習の測定対象
正常患者・脂質異常患者（dyslipidemic patient、“ill”）の血漿について、総コレステロールtotal cholesterol総コレステロール（total cholesterol）total cholesterol（総コレステロール）・HDL-コレステロール・トリグリセリドを測定する。総コレステロールtotal cholesterol総コレステロール（total cholesterol）total cholesterol（総コレステロール）からHDL-コレステロールを差し引き（Friedewald式Friedewald equationFriedewald式（Friedewald equation）Friedewald equation（Friedewald式）などを用いれば）LDL-コレステロールも推定できる。
まとめ
- 血漿脂質はコレステロール・TAG・リン脂質からなり、リポタンパク（HDL/VLDL/LDL/カイロミクロンchylomicronカイロミクロン（chylomicron）chylomicron（カイロミクロン））として輸送される。
- 高リポタンパク血症Hyperlipoproteinemia高リポタンパク血症（Hyperlipoproteinemia）Hyperlipoproteinemia（高リポタンパク血症）は動脈硬化・心筋梗塞と強く相関する（臨床的背景）。
- コレステロール測定はエステラーゼ→オキシダーゼ→ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）の3段階酵素法（505 nm付近で発色）。
- トリグリセリド測定はリパーゼ→グリセロールキナーゼglycerol kinaseグリセロールキナーゼ（glycerol kinase）glycerol kinase（グリセロールキナーゼ）→G3Pオキシダーゼ→ペルオキシダーゼperoxidaseペルオキシダーゼ（peroxidase）peroxidase（ペルオキシダーゼ）の4段階酵素法。
- HDL-コレステロールは、Ca/Mg/Mnイオン＋ポリアニオンpolyanionポリアニオン（polyanion）polyanion（ポリアニオン）でVLDL/LDLを沈殿precipitation沈殿（precipitation）precipitation（沈殿）除去した上清supernatant上清（supernatant）supernatant（上清）を同じ酵素法で測定する。