組織学的手法・顕微鏡：組織標本の作製

🧠 標本作製は「固定→包埋 embedding 包埋（embedding） embedding（包埋） →薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） →染色」という4段階の直列 serial (organ architecture, vs. parallel) 直列（serial (organ architecture, vs. parallel)） serial (organ architecture, vs. parallel)（直列） プロセス processプロセス（process） process（プロセス）、と丸ごと1本の流れとして覚える。 どの段階も目的は一貫していて、生きた組織を「壊さず・支えられる状態で・薄く・見える形」にすることにある。各段階で使う薬剤・機器を覚えるより先に、この4段階の目的（保存・支持・薄切sectioning 薄切（sectioning）sectioning（薄切） 可能化・可視化）を押さえるのが近道。

光学顕微鏡標本作製の4段階

ヒトまたは動物の正常組織を採取してから、光学顕微鏡light microscopy, LM 光学顕微鏡（light microscopy, LM）light microscopy, LM（光学顕微鏡） で観察できる標本になるまでには、以下の4段階を経る。

flowchart TD
  A["① <span class='jp-term jp-term-diagram' title='sample collection'>試料採取</span><br>1cm³未満の組織片"]
  A --> B["② 固定<br>組織を永久的に保存し<span class='jp-term jp-term-diagram' title='autolysis'>自己融解</span>を防ぐ"]
  B --> C["③ <span class='jp-term jp-term-diagram' title='embedding'>包埋</span><br>脱水→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='paraffin'>パラフィン</span>に置換し力学的支持を与える"]
  C --> D["④ <span class='jp-term jp-term-diagram' title='sectioning'>薄切</span><br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='microtome'>ミクロトーム</span>で2〜10μmに<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sectioning'>薄切</span>"]
  D --> E["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='staining'>染色</span>＝次節"]

固定

固定の目的は、組織を永久的に保存すること、および自己融解autolysis 自己融解（autolysis）autolysis（自己融解） のような変性過程の進行を防ぐ／止めることにある。

• 物理的固定physical fixation物理的固定（physical fixation）physical fixation（物理的固定）：加熱・マイクロ波microwaveマイクロ波（microwave）microwave（マイクロ波）・凍結
• 化学的固定chemical fixation化学的固定（chemical fixation）chemical fixation（化学的固定）：アルデヒド類（ホルムアルデヒドformaldehyde ホルムアルデヒド（formaldehyde）formaldehyde（ホルムアルデヒド） ＋ホルマリン, formaldehyde/formalin）、アルコール類alcoholsアルコール類（alcohols）alcohols（アルコール類）、重金属heavy metals重金属（heavy metals）heavy metals（重金属）

⚠️ 固定が不十分だと組織は自己融解 autolysis 自己融解（autolysis） autolysis（自己融解） で構造が崩れ、逆に固定が強すぎたり時間が長すぎたりすると抗原性 antigenicity 抗原性（antigenicity） antigenicity（抗原性） が失われ、後の免疫染色（00-3-immunolabeling-molecular）に支障が出る——固定は「保存」と「その後の解析可能性の維持」のトレードオフ trade-off トレードオフ（trade-off） trade-off（トレードオフ） でもある。

💡 固定条件は経験則 rules of thumb 経験則（rules of thumb） rules of thumb（経験則） ではなく数値で標準化されている。 乳癌のホルモン受容体 hormone receptorホルモン受容体（hormone receptor） hormone receptor（ホルモン受容体）・HER2HER2（human epidermal growth factor receptor 2）検査では、10%中性緩衝ホルマリンでの固定時間を6〜72時間の範囲に収めることが推奨され、この窓を外れた検体は判定に注釈が要る¹。さらに、摘出してから固定液に入れるまでの時間（冷虚血時間）も2010年のASCO/CAP改訂で管理項目として明文化された（実測では冷虚血時間3時間までならHER2の免疫染色・in situ ハイブリダイゼーションhybridization ハイブリダイゼーション（hybridization）hybridization（ハイブリダイゼーション） は劣化しない）²。⭐ ガイドライン本文は「組織採取から固定までをできるだけ短く」と書くだけで上限を数値で断定していないが、固定開始が1時間を超えて遅れた検体は6時間未満・72時間超の固定と並んで「判定不能indeterminate 判定不能（indeterminate）indeterminate（判定不能） となりうる」例に挙げられている³。実務で使われる「冷虚血時間1時間以内」という目安はこの記載に由来する、という位置づけで覚える。標本の質は「どれだけ強く固めたか」ではなく「いつから何時間固めたか」で決まる、と押さえておく。

包埋〜薄切

固定された組織はそのままでは軟らかすぎて薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） できないため、脱水でアルコールに置換し、続いてキシレンxyleneキシレン（xylene）xylene（キシレン）でアルコールを除去したうえでパラフィンparaffinパラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン）に包埋 embedding 包埋（embedding） embedding（包埋） する。パラフインブロックになった組織をミクロトームmicrotomeミクロトーム（microtome）microtome（ミクロトーム）で2〜10μmの薄い切片に切り出すことで、光を透過する半透明な標本が得られる。

💡 パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 切片作製の途中で組織中の脂質はアルコール・キシレンxylene キシレン（xylene）xylene（キシレン） によって溶け出してしまう。そのため通常のH&E標本で脂肪細胞 adipocyte 脂肪細胞（adipocyte） adipocyte（脂肪細胞） が「空胞vacuole 空胞（vacuole）vacuole（空胞） のような薄い輪」に見えるのは標本作製上のアーチファクト artifact アーチファクト（artifact） artifact（アーチファクト） であり、生体内in vivo 生体内（in vivo）in vivo（生体内） では脂肪滴で満たされている（脂肪染色には別途 00-5-other-methods の凍結切片 frozen section 凍結切片（frozen section） frozen section（凍結切片） ＋脂溶性色素が必要）。

まとめ

• 光顕標本作製は試料採取 sample collection 試料採取（sample collection） sample collection（試料採取） →固定→包埋 embedding 包埋（embedding） embedding（包埋） →薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） の4段階からなり、続いて染色を行う。
• 固定の目的は組織の永久保存と自己融解 autolysis 自己融解（autolysis） autolysis（自己融解） の阻止で、物理的固定physical fixation 物理的固定（physical fixation）physical fixation（物理的固定） と化学的固定 chemical fixation 化学的固定（chemical fixation） chemical fixation（化学的固定） （アルデヒド・アルコール・重金属heavy metals重金属（heavy metals）heavy metals（重金属））がある。
• 包埋embedding 包埋（embedding）embedding（包埋） は脱水・キシレンxylene キシレン（xylene）xylene（キシレン） 置換・パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 包埋 embedding 包埋（embedding） embedding（包埋） により力学的支持を与え、ミクロトームmicrotome ミクロトーム（microtome）microtome（ミクロトーム） で2〜10μmに薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） する。
• 固定は時間管理が本体で、免疫染色を前提とする検体ではホルマリン固定6〜72時間・冷虚血時間の短縮が推奨される。
• パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 法では脂質が処理中に失われるため、脂肪染色には凍結切片 frozen section 凍結切片（frozen section） frozen section（凍結切片） など別法が必要になる。