組織学的手法・顕微鏡：免疫標識と分子的手法

🧠 免疫標識immunolabeling 免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識） は「抗体が特定のタンパク質を見つけ、色や光に変換して教えてくれる」技術、分子的手法in situ hybridization 分子的手法（in situ hybridization）in situ hybridization（分子的手法） は「核酸プローブnucleic acid probe 核酸プローブ（nucleic acid probe）nucleic acid probe（核酸プローブ） が特定のDNADNA（deoxyribonucleic acid）/RNARNA（ribonucleic acid）配列を見つけて教えてくれる」技術——標的がタンパク質か核酸かの違い、と2系統に整理する。 H&Eや特殊染色 special stains 特殊染色（special stains） special stains（特殊染色） （00-2-staining）が分子の「化学的性質」を頼りに染めるのに対し、免疫標識immunolabeling免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識）・分子的手法in situ hybridization 分子的手法（in situ hybridization）in situ hybridization（分子的手法） は「分子の同一性 pathway identity 同一性（pathway identity） pathway identity（同一性） （何であるか）」をピンポイントで可視化する点が本質的な違い。

免疫組織化学

免疫標識immunolabeling 免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識） は、抗原抗体反応antigen-antibody reaction 抗原抗体反応（antigen-antibody reaction）antigen-antibody reaction（抗原抗体反応） （antigen–antibody reaction）を利用して組織切片 tissue section 組織切片（tissue section） tissue section（組織切片） 中の特定のタンパク質（抗原）を可視化する手法である。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primary antibody'>一次抗体</span>が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='target antigen'>標的抗原</span>に結合"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='direct method'>直接法</span>：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primary antibody'>一次抗体</span>自体に標識（色素・蛍光・酵素）"]
  A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='indirect method'>間接法</span>：標識した二次抗体（secondary antibody）が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='primary antibody'>一次抗体</span>に結合"]
  C --> D["シグナル増幅により感度が向上"]

標識には主に以下が用いられる。

• 酵素標識enzyme label酵素標識（enzyme label）enzyme label（酵素標識）：西洋わさびペルオキシダーゼ horseradish peroxidase (HRP) 西洋わさびペルオキシダーゼ（horseradish peroxidase (HRP)） horseradish peroxidase (HRP)（西洋わさびペルオキシダーゼ） などが基質を発色させ、光学顕微鏡light microscopy, LM 光学顕微鏡（light microscopy, LM）light microscopy, LM（光学顕微鏡） で観察（＝免疫組織化学 immunohistochemistry (IHC)免疫組織化学（immunohistochemistry (IHC)） immunohistochemistry (IHC)（免疫組織化学） IHC の狭義）
• 蛍光標識fluorescent label蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識）：蛍光色素 fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素） （フルオレセインfluorescein フルオレセイン（fluorescein）fluorescein（フルオレセイン） など）を用い、蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）・共焦点顕微鏡confocal microscopy 共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡） （00-4-microscopy）で観察（＝免疫蛍光法 immunofluorescence assay (IFA)免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)） immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法））

⭐ 免疫標識immunolabeling 免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識） は「その分子が何であるか」を特定できる点でH&Eより遥かに特異的だが、目的の抗原に対する抗体が存在し、かつ固定によって抗原性 antigenicity 抗原性（antigenicity） antigenicity（抗原性） が保たれていることが前提となる——過度なホルマリン固定（00-1-tissue-preparation）は抗原性 antigenicity 抗原性（antigenicity） antigenicity（抗原性） を損なうため、免疫染色を予定する検体では固定条件の調整（抗原賦活化 activation賦活化（activation） activation（賦活化） antigen retrieval など）が必要になる。

💡 「1切片あたり1〜数種類」という制約 Limitations 制約（Limitations） Limitations（制約） はすでに外れている（多重染色）。 蛍光標識fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識） は色（波長）の数で重なりが決まるため、従来は同時に見られる分子が3〜4種に限られていた。この壁を越えるために、標識を色ではなく別の物理量に置き換える方法が実用化している。希土類金属で抗体を標識し、レーザーで削り取って質量分析 mass spectrometry 質量分析（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析） にかけるイメージング質量サイトメトリーは、1枚の切片で32種のタンパク質・修飾を細胞内分解能で同時に測れる（同位体isotope 同位体（isotope）isotope（同位体） を足せば100種超も原理的に可能）¹。抗体にDNAバーコードを付けて反復的に読み出す方式も同様に高多重化を実現している。目的は「どの細胞がどの分子をもつか」から「どの細胞がどの細胞の隣にいるか」へ移っている。

in situ ハイブリダイゼーション

核酸プローブnucleic acid probe核酸プローブ（nucleic acid probe）nucleic acid probe（核酸プローブ）を用いて、組織切片tissue section組織切片（tissue section）tissue section（組織切片）・細胞内の特定のDNA/RNA配列を直接検出する手法。

• 標識した相補的な一本鎖プローブを組織に反応させ、標的配列とハイブリダイズ（相補的に結合）させる。
• 蛍光in situハイブリダイゼーション hybridizationハイブリダイゼーション（hybridization） hybridization（ハイブリダイゼーション）は染色体異常の検出（特定遺伝子座のコピー数 copy numberコピー数（copy number） copy number（コピー数）・転座）などに用いられる。
• mRNAの発現部位を組織内で直接可視化できるため、「どの細胞がその遺伝子を発現しているか」を空間的に把握 grasp 把握（grasp） grasp（把握） できる。
• 従来のRNA用ISHは感度・特異度が不足して臨床にはほとんど使われなかったが、分岐型プローブでシグナルを増幅する RNAscope がホルマリン固定パラフィン paraffin パラフィン（paraffin） paraffin（パラフィン） 包埋 embedding 包埋（embedding） embedding（包埋） 切片上での単一RNA分子レベル molecular 分子レベル（molecular） molecular（分子レベル） の検出を可能にし、位置づけが変わった²。

💡 ISHの延長線上に空間トランスクリプト crypt クリプト（crypt） crypt（クリプト） ームがある。 ISHは「あらかじめ決めた1つの配列を探しに行く」手法だが、位置バーコード付き逆転写プライマーを並べたアレイの上に組織切片 tissue section 組織切片（tissue section） tissue section（組織切片） を載せると、切片の二次元位置情報 positional information 位置情報（positional information） positional information（位置情報） を保ったままトランスクリプト crypt クリプト（crypt） crypt（クリプト） ーム全体をRNA-seqで読める³。標的を先に決めずに「どこで何が発現しているか」を網羅的に得る点がISHとの本質的な違いで、Nature Methods はこの空間分解トランスクリプトミクス transcriptomics トランスクリプトミクス（transcriptomics） transcriptomics（トランスクリプトミクス） を2020年のMethod of the Yearに選んでいる⁴。組織学の観察対象が「形態＋数分子」から「形態＋全遺伝子発現」へ広がりつつある、という位置づけで押さえておく。

💡 免疫標識immunolabeling 免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識） がタンパク質、in situ ハイブリダイゼーションhybridization ハイブリダイゼーション（hybridization）hybridization（ハイブリダイゼーション） がDNA/RNAをそれぞれ標的とする、という対応を軸に覚えると、「タンパク質発現を見たいのか、遺伝子発現・染色体異常を見たいのか」という目的からどちらの手法を選ぶべきかを即座に判断できる。

まとめ

• 免疫標識immunolabeling 免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識） は抗原抗体反応 antigen-antibody reaction 抗原抗体反応（antigen-antibody reaction） antigen-antibody reaction（抗原抗体反応） を利用し、特定のタンパク質を酵素標識 enzyme label 酵素標識（enzyme label） enzyme label（酵素標識） または蛍光標識 fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label） fluorescent label（蛍光標識） で可視化する。
• 間接法indirect method 間接法（indirect method）indirect method（間接法） （標識二次抗体を使用）はシグナル増幅により直接法 direct method 直接法（direct method） direct method（直接法） より高感度で、現在の主流。
• in situ ハイブリダイゼーションhybridization ハイブリダイゼーション（hybridization）hybridization（ハイブリダイゼーション） は核酸プローブ nucleic acid probe 核酸プローブ（nucleic acid probe） nucleic acid probe（核酸プローブ） で特定のDNA/RNA配列を検出し、FISHFISH（fluorescence in situ hybridization）は染色体異常の検出などに用いられる。
• 免疫標識immunolabeling 免疫標識（immunolabeling）immunolabeling（免疫標識） は金属標識・DNAバーコード標識により1切片で数十種の分子を同時に見る多重染色へ、ISHはRNAscopeによる単分子検出と空間トランスクリプト crypt クリプト（crypt） crypt（クリプト） ームへと拡張されている。
• IHC＝タンパク質標的、ISH＝核酸標的という違いが手法選択の軸になる。