組織学的手法・顕微鏡：顕微鏡法

🧠 顕微鏡法は「何で見るか（光か電子か）」と「どう見るか（明視野brightfield 明視野（brightfield）brightfield（明視野） か蛍光か位相差 phase difference 位相差（phase difference） phase difference（位相差） か）」の掛け合わせとして整理する。 解像度resolution 解像度（resolution）resolution（解像度） を決めるのは光源の波長で、電子線electron beam 電子線（electron beam）electron beam（電子線） は可視光よりずっと波長が短いため電子顕微鏡 electron microscopy, EM 電子顕微鏡（electron microscopy, EM） electron microscopy, EM（電子顕微鏡） （EM）は光学顕微鏡 light microscopy, LM 光学顕微鏡（light microscopy, LM） light microscopy, LM（光学顕微鏡） （LM）よりはるかに高い分解能をもつ——この一点さえ押さえれば、なぜ細胞小器官 organelles 細胞小器官（organelles） organelles（細胞小器官） の詳細観察にEMが必須なのかが導ける。

光学顕微鏡と分解能

顕微鏡の性能を決める最も重要な指標は分解能＝2点を別々のものとして識別できる最小距離であり、これは主に使用する光（または電子線 electron beam電子線（electron beam） electron beam（電子線））の波長によって決まる。

flowchart TD
  A["分解能を決めるもの＝光源の波長"]
  A --> B["可視光（波長が長い）→ LM系：分解能 約0.2μm"]
  B --> B2["蛍光分子の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='quenching'>消光</span>・点滅を使えば回折限界の下へ<br>超解像顕微鏡：20〜100nm"]
  A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='electron beam'>電子線</span>（波長が極めて短い）→ EM：分解能 約0.2nm"]

💡 「なぜ光学顕微鏡 light microscopy, LM 光学顕微鏡（light microscopy, LM） light microscopy, LM（光学顕微鏡） ではリボソームや膜の詳細が見えないのか」という疑問への答えは、光の波長そのものがそれらの構造よりも大きいから、という一点に尽きる。電子線electron beam 電子線（electron beam）electron beam（電子線） は波長が桁違いに短いため、はじめて細胞小器官 organelles 細胞小器官（organelles） organelles（細胞小器官） の内部構造（01-2-membranous-organelles）を「見る」ことができる。

⚠️ 「約0.2μmが光の限界」は、いまは光学系そのものの限界であって、蛍光観察の限界ではない。 回折限界は「1点を1点として結像できるか」の話なので、蛍光分子を時間的にずらして光らせればその下に潜れる。焦点の周縁だけを誘導放出 stimulated emission 誘導放出（stimulated emission） stimulated emission（誘導放出） で消してスポットを絞るSTEDは直径90〜110nmの蛍光スポットを実現し（共焦点の18分の1の体積）¹、一度に一部の分子だけを光らせて位置を精密に決め多数の像を重ね合わせるPALM/STORMは20nm級の分解能を示した²。これら超解像顕微鏡は2014年のノーベル化学賞の対象になっている。上の表で共焦点顕微鏡 confocal microscopy 共焦点顕微鏡（confocal microscopy） confocal microscopy（共焦点顕微鏡） を「約0.2μm」と書いているのは通常の共焦点にはこの仕掛けが無いからであって、光を使うかぎり0.2μmが上限、という意味ではない。

電子顕微鏡

電子顕微鏡electron microscopy, EM 電子顕微鏡（electron microscopy, EM）electron microscopy, EM（電子顕微鏡） には大きく2種類があり、観察したい情報（内部構造か表面形態か）によって使い分ける。

⚠️ EM標本は通常のパラフィン paraffin パラフィン（paraffin） paraffin（パラフィン） 法（00-1-tissue-preparation）よりはるかに厳密な固定（グルタルアルデヒドglutaraldehyde グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）glutaraldehyde（グルタルアルデヒド） 固定など）と、樹脂包埋 embedding包埋（embedding） embedding（包埋）・極薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） 片化を必要とする——H&E用の固定条件をそのままEM観察に流用することはできない点に注意。

💡 TEM/SEMの二分に、いまは「凍らせる」と「積む」という2つの軸が加わっている。 ひとつはクライオ電子顕微鏡 electron microscopy, EM電子顕微鏡（electron microscopy, EM） electron microscopy, EM（電子顕微鏡）で、化学固定も染色もせず試料を急速凍結（ガラス化）したまま観察するため、固定・脱水による変形を受けない状態の分子を見られる。多数の粒子像を計算で平均する単粒子解析は1.7Å級、すなわちタンパク質中の個々の原子が見える水準に達しており³、構造生物学の主要手法になった（2017年ノーベル化学賞）。もうひとつは体積電子顕微鏡 electron microscopy, EM電子顕微鏡（electron microscopy, EM） electron microscopy, EM（電子顕微鏡）で、走査型電子顕微鏡scanning electron microscope, SEM 走査型電子顕微鏡（scanning electron microscope, SEM）scanning electron microscope, SEM（走査型電子顕微鏡） の試料室内で薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） とブロック表面の撮像を自動で繰り返すSBF-SEMなどにより、数百μmの組織を最も細い細胞突起やシナプス小胞 synaptic vesicle シナプス小胞（synaptic vesicle） synaptic vesicle（シナプス小胞） まで追える分解能で三次 tertiary 三次（tertiary） tertiary（三次） 元再構築 remodel 再構築（remodel） remodel（再構築） できる⁴。「EM＝2次元の極薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） 片1枚」という枠は現在では当てはまらない。

標識との組み合わせ

蛍光顕微鏡fluorescence microscope蛍光顕微鏡（fluorescence microscope）fluorescence microscope（蛍光顕微鏡）・共焦点顕微鏡confocal microscopy 共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡） は免疫蛍光法 immunofluorescence assay (IFA) 免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)） immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法） （00-3-immunolabeling-molecular）と組み合わせることで、特定分子の局在を細胞内・組織内で高い空間分解能 spatial resolution 空間分解能（spatial resolution） spatial resolution（空間分解能） で可視化できる。共焦点顕微鏡confocal microscopy 共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡） は焦点面以外からの光をピンホールで除去することで光学的切片optical section光学的切片（optical section）optical section（光学的切片）を得られるため、厚みのある試料でも鮮明な像が得られ、複数の光学切片 optical section 光学切片（optical section） optical section（光学切片） を重ねて三次 tertiary 三次（tertiary） tertiary（三次） 元再構築 remodel 再構築（remodel） remodel（再構築） することも可能である。

まとめ

• 顕微鏡の分解能は主に光源（光か電子線 electron beam 電子線（electron beam） electron beam（電子線） か）の波長によって決まり、電子線electron beam 電子線（electron beam）electron beam（電子線） は可視光よりはるかに波長が短いためEMはLMよりずっと高分解能 high resolution, HR高分解能（high resolution, HR） high resolution, HR（高分解能）。
• LM系には明視野 brightfield明視野（brightfield） brightfield（明視野）・位相差phase difference位相差（phase difference）phase difference（位相差）・蛍光・共焦点顕微鏡confocal microscopy 共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡） があり、目的（染色標本か生細胞か標識分子 marker molecule 標識分子（marker molecule） marker molecule（標識分子） の局在か）に応じて使い分ける。
• EMにはTEM（内部微細構造）とSEM（表面の立体形態）があり、専用の固定・包埋embedding 包埋（embedding）embedding（包埋） 法が必要。
• 回折限界（約0.2μm）は超解像顕微鏡（STED・PALM/STORM、20〜100nm）で越えられ、EM側もクライオ電顕 electron microscopy, EM 電顕（electron microscopy, EM） electron microscopy, EM（電顕） （原子分解能）と体積EM（三次tertiary 三次（tertiary）tertiary（三次） 元再構築 remodel再構築（remodel） remodel（再構築））へ広がっている。
• 共焦点顕微鏡confocal microscopy 共焦点顕微鏡（confocal microscopy）confocal microscopy（共焦点顕微鏡） は光学的切片 optical section 光学的切片（optical section） optical section（光学的切片） 化により3D再構築 remodel 再構築（remodel） remodel（再構築） が可能で、免疫蛍光法immunofluorescence assay (IFA) 免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)）immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法） との相性がよい。