組織学的手法・顕微鏡：その他の手法

🧠 パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 法（00-1-tissue-preparation）でどうしても失われる情報（脂質・酵素活性・迅速性）を補うための「代替ルート」の集合、と位置づけて覚える。 凍結切片frozen section 凍結切片（frozen section）frozen section（凍結切片） は「速さ」、脂質染色は「パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 法で溶けてしまう脂肪」、細胞診・培養・オートラジオグラフィーAutoradiography オートラジオグラフィー（Autoradiography）Autoradiography（オートラジオグラフィー） は「組織ではなく細胞・分子の動態」を見るための手法——それぞれ何を犠牲にして何を得ているかで整理する。

凍結切片法

パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 法は脱水・包埋embedding 包埋（embedding）embedding（包埋） に時間がかかるため、手術中の迅速診断 intraoperative diagnosis迅速診断（intraoperative diagnosis） intraoperative diagnosis（迅速診断）には向かない。凍結切片法Frozen section 凍結切片法（Frozen section）Frozen section（凍結切片法） は組織を急速凍結し、クリオスタットcryostatクリオスタット（cryostat）cryostat（クリオスタット）で薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） することで、数分〜十数分という短時間で標本を作製できる。

⭐ 凍結切片法Frozen section 凍結切片法（Frozen section）Frozen section（凍結切片法） の最大の強みは脂質を保持できる点——パラフィン paraffin パラフィン（paraffin） paraffin（パラフィン） 法では処理過程で脂質が溶け出してしまう（00-1-tissue-preparation参照）ため、脂肪染色（オイルレッドOil Red O オイルレッド（Oil Red O）Oil Red O（オイルレッド） Oなど）や一部の酵素組織化学は凍結切片 frozen section 凍結切片（frozen section） frozen section（凍結切片） でなければ行えない。

細胞診

組織全体ではなく、個々の細胞を対象に形態を評価する手法。剥離細胞診（塗抹標本smear preparation塗抹標本（smear preparation）smear preparation（塗抹標本）、パパニコロウPapanicolaou パパニコロウ（Papanicolaou）Papanicolaou（パパニコロウ） 染色 Papanicolaou stain による子宮頸部細胞診 cervical cytology 子宮頸部細胞診（cervical cytology） cervical cytology（子宮頸部細胞診） など）や穿刺吸引細胞診 fine-needle aspiration cytology (FNAC) 穿刺吸引細胞診（fine-needle aspiration cytology (FNAC)） fine-needle aspiration cytology (FNAC)（穿刺吸引細胞診） が代表例で、組織構築architecture 組織構築（architecture）architecture（組織構築） の情報は失われる代わりに、低侵襲かつ迅速に細胞レベル Cellular 細胞レベル（Cellular） Cellular（細胞レベル） の異型を評価できる。

細胞培養

生体から取り出した細胞をシャーレ内で増殖させ、生きたまま経時的 serial 経時的（serial） serial（経時的） に観察・実験する手法。組織を離れた環境での細胞の挙動（増殖・分化・シグナル応答）を調べられる一方、生体内in vivo 生体内（in vivo）in vivo（生体内） の微小環境（周囲の細胞・ECMECM（extracellular matrix）・血流など）を再現できない限界もある。

💡 「培養では組織構築 architecture 組織構築（architecture） architecture（組織構築） が再現できない」という限界は、三次tertiary 三次（tertiary）tertiary（三次） 元培養（オルガノイドorganoidオルガノイド（organoid）organoid（オルガノイド））で部分的に外れた。 細胞外基質extracellular matrix 細胞外基質（extracellular matrix）extracellular matrix（細胞外基質） ゲルと必要な増殖因子 growth factor 増殖因子（growth factor） growth factor（増殖因子） を与えると、単一のLgr5陽性腸上皮 intestinal epithelium 腸上皮（intestinal epithelium） intestinal epithelium（腸上皮） 幹細胞だけから、陰窩-絨毛構造をもち全ての分化細胞系列を含む三次 tertiary 三次（tertiary） tertiary（三次） 元構造が、間葉系Mesenchymal 間葉系（Mesenchymal）Mesenchymal（間葉系） ニッチ niche ニッチ（niche） niche（ニッチ） なしに組み上がる¹。組織学的に重要なのは、これが「陰窩-絨毛単位は自己組織化 self-assembly 自己組織化（self-assembly） self-assembly（自己組織化） する」ことの証明になっている点で、上皮の空間構造が周囲の結合組織に指示されて出来るとは限らない、と読み替えられる。ただし血管・神経・免疫細胞immune cell 免疫細胞（immune cell）immune cell（免疫細胞） は含まれないため、生体の微小環境を全て置き換えるものではない。

オートラジオグラフィーとフローサイトメトリー

• オートラジオグラフィーAutoradiographyオートラジオグラフィー（Autoradiography）Autoradiography（オートラジオグラフィー）：放射性同位体 radioisotope (radioactive isotope) 放射性同位体（radioisotope (radioactive isotope)） radioisotope (radioactive isotope)（放射性同位体） で標識した分子（例：³H-チミジン）を組織・細胞に取り込ませ、放射線による感光を利用してその分子の局在・動態を可視化する手法。DNADNA（deoxyribonucleic acid）合成中の細胞（S期）の同定などに用いられてきた。ただし増殖細胞の標識という用途では、放射線を使わないチミジン類似体 thymidine analogue チミジン類似体（thymidine analogue） thymidine analogue（チミジン類似体） に置き換わっている——BrdUに続いて登場したEdU＋クリック click クリック（click） click（クリック） 反応は、蛍光アジドとの反応が数分で終わり、BrdUと違って固定やDNA変性を必要としないため構造保存がよく、ホールマウント標本の深部にも届く²。
• フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）：蛍光標識 fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label） fluorescent label（蛍光標識） した抗体で細胞集団を染色し、細胞を一つずつレーザー光の中を通過させて蛍光・散乱光scattered light 散乱光（scattered light）scattered light（散乱光） を測定することで、大量の細胞を高速に分類・定量する手法。血液細胞・リンパ球サブセットlymphocyte subsets リンパ球サブセット（lymphocyte subsets）lymphocyte subsets（リンパ球サブセット） の解析（07-1-cells-general）などに用いられる。蛍光の色数で同時測定できるマーカー数が決まる点が制約 Limitations 制約（Limitations） Limitations（制約） で、これを外すために抗体を金属で標識して質量分析 mass spectrometry 質量分析（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析） で読むマスサイトメトリーが作られ、ヒト骨髄の単一細胞で34パラメータ Parameter パラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ） の同時測定が示されている³。

💡 「なぜ手術中に迅速診断 intraoperative diagnosis 迅速診断（intraoperative diagnosis） intraoperative diagnosis（迅速診断） が必要な場面ではパラフィン paraffin パラフィン（paraffin） paraffin（パラフィン） 法を使わないのか」という問いへの答えは単純で、パラフィンparaffin パラフィン（paraffin）paraffin（パラフィン） 法は脱水・包埋embedding 包埋（embedding）embedding（包埋） だけで数時間かかり、手術の進行に間に合わないから。凍結切片法Frozen section 凍結切片法（Frozen section）Frozen section（凍結切片法） は形態の精密さを多少犠牲にしてでも「速さ」を取る手法だと理解しておくと、なぜ両者が併存しているかが腑に落ちる。

まとめ

• 凍結切片法Frozen section 凍結切片法（Frozen section）Frozen section（凍結切片法） は急速凍結とクリオスタット cryostat クリオスタット（cryostat） cryostat（クリオスタット） 薄切 sectioning 薄切（sectioning） sectioning（薄切） により迅速診断 intraoperative diagnosis 迅速診断（intraoperative diagnosis） intraoperative diagnosis（迅速診断） や脂質染色を可能にするが、形態保持の精密さはパラフィン paraffin パラフィン（paraffin） paraffin（パラフィン） 法にやや劣る。
• 細胞診は個々の細胞を対象とし、組織構築architecture 組織構築（architecture）architecture（組織構築） の情報を失う代わりに低侵襲・迅速な評価ができる。
• 細胞培養cell culture 細胞培養（cell culture）cell culture（細胞培養） は生きた細胞の経時観察を可能にするが、生体内in vivo 生体内（in vivo）in vivo（生体内） の微小環境を完全には再現できない。
• オートラジオグラフィーAutoradiography オートラジオグラフィー（Autoradiography）Autoradiography（オートラジオグラフィー） は放射性標識分子 marker molecule 標識分子（marker molecule） marker molecule（標識分子） の動態を、フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） は蛍光標識 fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label） fluorescent label（蛍光標識） 細胞集団の高速分類・定量を可能にする。
• 増殖細胞の標識はEdU＋クリック click クリック（click） click（クリック） 反応へ、フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） は金属標識のマスサイトメトリー（34パラメータ Parameter パラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ） 同時）へ、平面培養はオルガノイド organoid オルガノイド（organoid） organoid（オルガノイド） へと、それぞれ後継の手法が加わっている。