Molecular Cell Biology · 29

リアルタイムPCRおよびDNAマイクロアレイ法による遺伝子発現の解析

Investigation of gene expression by real-time PCR and DNA-microarray methodology

🧠 リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）は「1遺伝子を高精度に定量する」ための技術、DNAマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）は「数千遺伝子を同時に、荒い解像度resolution解像度（resolution）resolution（解像度）で比較する」ための技術——両者は解像度resolution解像度（resolution）resolution（解像度）とスループットのトレードオフtrade-offトレードオフ（trade-off）trade-off（トレードオフ）の両極に位置する。リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）の鍵は蛍光シグナルを増幅過程中に読み取ること、マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）の鍵は実験サンプルと参照サンプルを異なる色（赤・緑）で標識し競合的competitive競合的（competitive）competitive（競合的）にハイブリダイズさせることで、相対発現量を「色」として可視化する点にある。

遺伝子発現研究の目的

遺伝子発現を研究する目的は、遺伝子とそれがコードするタンパク質が生体内in vivo生体内（in vivo）in vivo（生体内）でどのように機能するかを決定することである。それを知る最良の方法の1つは、ある遺伝子を取り除き、生物がそれを欠いたときに何が起こるかを見ることである。この過程が成立するには、どの遺伝子がどれだけあるか——そして正しい遺伝子であるかを知る必要がある。

リアルタイムPCR

DNAポリメラーゼが単離できた調査対象DNAのコピーを作るPCRの一種
最終産物の電気泳動の代わりに、各熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）後にこれを定量する——結果はPCRの最中に得られ、後ではない
リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）は配列特異的プライマー（プローブ）を標識する蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）を用いる
蛍光検出fluorescence detection蛍光検出（fluorescence detection）fluorescence detection（蛍光検出）を備えた特殊なサーマルサイクラーが各サイクル中の蛍光をモニタリングする
測定された蛍光は増幅されたDNA産物（アンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン））の総量に比例し、経時的serial経時的（serial）serial（経時的）な蛍光強度の変化から各サイクルで産生されたアンプリコンampliconアンプリコン（amplicon）amplicon（アンプリコン）量を算出できる

通常のPCRと比較して可能なこと：

より効率的——各熱サイクルthermal cycling熱サイクル（thermal cycling）thermal cycling（熱サイクル）後に調査対象DNAを検出できるため
DNA産物の定量的決定——通常のPCRではマーカーを用いて遺伝子の有無しか判定できないが、リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）では（グラム単位で）どれだけあるかを決定できる

リアルタイムPCRグラフ

閾値レベルthreshold level閾値レベル（threshold level）threshold level（閾値レベル）が定義される——より高強度の蛍光のみが解析対象となる
指数関数期exponential phase指数関数期（exponential phase）exponential phase（指数関数期）では、PCR産物量は各サイクルでおよそ倍加する
反応が進むにつれ反応成分（酵素/基質）が消費され、最終的に反応を制限する——この時点で反応は減速deceleration減速（deceleration）deceleration（減速）し非指数関数期exponential phase指数関数期（exponential phase）exponential phase（指数関数期）に入り、その後プラトーplateauプラトー（plateau）plateau（プラトー）期が続く

検出技術

蛍光検出fluorescence detection蛍光検出（fluorescence detection）fluorescence detection（蛍光検出）は特異的または非特異的でありうる。

非特異的検出： 任意のPCR産物

DNA結合色素（SYBR greenなど）は、PCR混合物中の全ての二本鎖DNAに結合する色素——結合すると色素が蛍光を発する
PCR中のDNA産物増加は蛍光強度の増加につながり、各サイクルで検出器により測定できる
ただしこの方法はやや不正確である——全てのdsDNAに結合するため、プライマーダイマーprimer dimerプライマーダイマー（primer dimer）primer dimer（プライマーダイマー）（二量化した一本鎖プライマー→二本鎖プライマー）にも結合してしまい、標的配列の正確なモニタリングを妨げる

特異的検出： レポータープローブ法

PCR産物の特異的検出は蛍光レポータープローブを用いて行われる
これらのプローブは一端に蛍光レポーター、他端にクエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）で標識されたDNA断片である
クエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）の近接がその蛍光の検出を妨げるが、アニーリングannealingアニーリング（annealing）annealing（アニーリング）中（プローブがDNAポリメラーゼにより相補的ssDNA鎖に結合したとき）、クエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）は（Taq）DNAポリメラーゼの5′エキソヌクレアーゼ活性exonuclease activityエキソヌクレアーゼ活性（exonuclease activity）exonuclease activity（エキソヌクレアーゼ活性）により除去される
クエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）の除去により、レポーターから発せられる蛍光が照射時に検出可能となる＝蛍光を妨げる近接クエンチャーquencherクエンチャー（quencher）quencher（クエンチャー）がなくなる
プローブがプライマーダイマーprimer dimerプライマーダイマー（primer dimer）primer dimer（プライマーダイマー）の一部にならないため、これはPCR産物測定のより正確な方法である
蛍光はリアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）装置で検出・測定される

リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）により鋳型DNAを相対的・絶対的absolute絶対的（absolute）absolute（絶対的）の両方で決定できる（17-function-and-application-of-pcr-and-real-time-pcr参照）。

定量解析の原理

閾値強度： 効率的な相（指数関数期exponential phase指数関数期（exponential phase）exponential phase（指数関数期））において信頼性reliability信頼性（reliability）reliability（信頼性）高く検出できる強度（PCR産物量）
閾値サイクルthreshold cycle, Ct閾値サイクル（threshold cycle, Ct）threshold cycle, Ct（閾値サイクル）（Cт）： PCR産物量が閾値に等しくなる時点として算出されるサイクル数

絶対定量： DNA断片のグラム数または正確な量を決定する（例：試料中のウイルス量）。これには、設定された閾値強度とその強度に達するために必要なサイクル数を用いた検量線calibration curve検量線（calibration curve）calibration curve（検量線）（希釈系列による）が必要。未知試料（例：ウイルス量）の解析はこの検量線calibration curve検量線（calibration curve）calibration curve（検量線）から得られる。

相対定量： ある化合物が転写活性transcriptional activity転写活性（transcriptional activity）transcriptional activity（転写活性）に及ぼす効果を調べることで試料同士を比較する——例：腫瘍試料は健常試料より10倍多くのPCR産物を持ちうる→mRNA量を測定する。mRNAは逆転写酵素により相補的DNA（cDNA）として存在する。定量はコントロール参照遺伝子量gene dosage遺伝子量（gene dosage）gene dosage（遺伝子量）に対するcDNAレベルの変化として表現される。

応用

SNPジェノタイピングgenotypingジェノタイピング（genotyping）genotyping（ジェノタイピング）： PCR終了後に検出される——2つのアレルに特異的なプローブにより検出され、これらのプローブは異なる色素（色）で標識される。例えばC/T多型がある場合、Cを含むプローブとTを含むプローブは異なる色を持つ→SNPを決定できる。

新規多型の同定：「融解曲線解析」 ——PCR産物を緩やかに加熱し、融解点（dsDNA→ssDNAとなる点、この時点で蛍光シグナルが減少する——dsDNAに結合したときのみ蛍光を発するため）を調べる。塩基配列が異なるDNA分子の融解点はH結合量（それを切るために必要なエネルギー量）により異なる——融解点（シグナル減少点）を調べることでDNA配列（多型）を調査できる。

DNAマイクロアレイ

DNAマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）（DNAチップとも呼ばれる）は、多数の遺伝子の発現レベルを同時に測定する、またはゲノム領域の遺伝子型を決定するために用いられる。

DNAマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）は顕微鏡スライドslideスライド（slide）slide（スライド）で、定義された位置（行と列）に数千の微小スポットが印刷されており、各スポットには既知のDNA配列/遺伝子が含まれる。

マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）解析を行うには、通常、実験サンプルと参照サンプルの両方からmRNA分子を採取する。例えば参照サンプルは健常個体から、実験サンプルは疾患を持つ人から採取できる。

flowchart TD
  A["実験サンプル・参照サンプルからmRNAを採取"] --> B["逆転写酵素でcDNAへ変換"]
  B --> C["実験cDNAを赤色<span class='jp-term jp-term-diagram' title='fluorescent dye'>蛍光色素</span>、参照cDNAを緑色<span class='jp-term jp-term-diagram' title='fluorescent dye'>蛍光色素</span>で標識"]
  C --> D["両サンプルを混合し<span class='jp-term jp-term-diagram' title='microarray'>マイクロアレイ</span><span class='jp-term jp-term-diagram' title='slide'>スライド</span>へ結合"]
  D --> E["スポット上のssDNAプローブがcDNAとハイブリダイズ（H結合形成）"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='complementation'>相補性</span>が高いほど強固に結合→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='aspecific binding'>非特異的結合</span>は洗浄除去"]
  F --> G["実験サンプルで発現高→赤／参照サンプルで発現高→緑／同等→黄"]
  G --> H["遺伝子発現プロファイルの作成"]

両方のmRNAサンプルは逆転写酵素により相補的DNA（cDNA）へ変換される——cDNAは基本的にmRNAのコピーだが化学的にはDNAである
実験cDNAは赤色蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）で標識され、参照cDNAは緑色色素で標識される→2つのサンプルは混合されマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）スライドslideスライド（slide）slide（スライド）へ結合させられる
マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）のスポット中の特異的DNA配列（プローブ）はssDNAであり、cDNA鎖を見つけて互いに結合する＝ハイブリダイゼーションhybridizationハイブリダイゼーション（hybridization）hybridization（ハイブリダイゼーション）（相補的ヌクレオチド塩基対base pairing塩基対（base pairing）base pairing（塩基対）間のH結合形成）
2本の鎖の相補性complementation相補性（complementation）complementation（相補性）が高いほど、より強固に結合する→非特異的結合aspecific binding非特異的結合（aspecific binding）aspecific binding（非特異的結合）配列を洗い流すことができる
ある特定の遺伝子の発現が参照サンプルより実験サンプルで高い場合→マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）上の対応スポットは赤色に見える。逆に実験サンプルでの発現が参照サンプルより低い場合→スポットは緑色に見える。両サンプルで発現が等しい場合→スポットは黄色に見える
マイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）を通じて収集されたデータは、特定の条件/処置への応答として多数の遺伝子発現の同時変化を示す遺伝子発現プロファイルの作成に利用できる

DNAマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）はSNP検出、ジェノタイピングgenotypingジェノタイピング（genotyping）genotyping（ジェノタイピング）、法医学forensic medicine法医学（forensic medicine）forensic medicine（法医学）的解析、創薬drug design創薬（drug design）drug design（創薬）、疾患への素因の測定など、多くの用途に利用できる。

まとめ

リアルタイムPCRreal-time PCRリアルタイムPCR（real-time PCR）real-time PCR（リアルタイムPCR）は蛍光シグナル（SYBR Green等の非特異的色素、またはTaqMan等の特異的プローブ）を増幅過程中にモニタリングすることで、DNAを定性的（相対定量）・定量的（絶対定量）の両方で解析できる。
絶対定量には希釈系列による検量線calibration curve検量線（calibration curve）calibration curve（検量線）が必要であり、相対定量は参照遺伝子に対する変化として発現量を表現する。
SNPジェノタイピングgenotypingジェノタイピング（genotyping）genotyping（ジェノタイピング）は色分けされたアレル特異的プローブにより、新規多型の同定は融解曲線解析（dsDNA→ssDNA転移点の検出）により行われる。
DNAマイクロアレイmicroarrayマイクロアレイ（microarray）microarray（マイクロアレイ）は数千のプローブスポットを用い、実験・参照サンプルのcDNAを異なる蛍光色で標識・競合ハイブリダイズさせることで、多数の遺伝子発現を同時に相対比較する（赤＝実験サンプルで高発現、緑＝参照サンプルで高発現、黄＝同等）。