遺伝子工学の生物医学的応用（トランスジェニック動物；ノックアウト・ノックイン・ノックダウン技術；クローニング）（EM学生のみ）

🧠 遺伝子改変動物GM animals 遺伝子改変動物（GM animals）GM animals（遺伝子改変動物） モデルは「遺伝子を足すか（トランスジェニック、ノックインknock-inノックイン（knock-in）knock-in（ノックイン））」「取り除くか（ノックアウトknock-outノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト））」「一時的に黙らせるか（ノックダウンknockdownノックダウン（knockdown）knockdown（ノックダウン））」という3つの操作の変奏である。 ノックアウトknock-out ノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト） が胚性幹細胞 embryonic stem cell 胚性幹細胞（embryonic stem cell） embryonic stem cell（胚性幹細胞） での相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） という「狙い撃ちだが手間のかかる」正攻法であるのに対し、ノックダウンknockdown ノックダウン（knockdown）knockdown（ノックダウン） （RNAi）は「遺伝子は残したまま発現量だけ下げる」という迅速で可逆的な代替手段であり、クローニングcloning クローニング（cloning）cloning（クローニング） （体細胞核移植somatic cell nuclear transfer (SCNT)体細胞核移植（somatic cell nuclear transfer (SCNT)）somatic cell nuclear transfer (SCNT)（体細胞核移植））はこれら全ての改変を個体レベルで固定・複製する技術として位置づけられる。

トランスジェニック動物

トランスジェニック動物transgenic animal トランスジェニック動物（transgenic animal）transgenic animal（トランスジェニック動物） とは、遺伝子操作により外来DNA（トランスジーン、transgene）がゲノムへ導入された動物である。トランスジーンは通常、その動物種には天然には存在しない遺伝子、または調節配列 regulatory sequence 調節配列（regulatory sequence） regulatory sequence（調節配列） が改変された内因性遺伝子のコピーである。

前核注入法

最も古典的なトランスジェニックマウス transgenic mouse トランスジェニックマウス（transgenic mouse） transgenic mouse（トランスジェニックマウス） 作製法。

1. 受精直後の受精卵 fertilized egg 受精卵（fertilized egg） fertilized egg（受精卵） （接合子zygote接合子（zygote）zygote（接合子））を採取する
2. マイクロインジェクションmicroinjection マイクロインジェクション（microinjection）microinjection（マイクロインジェクション） により、直鎖状のDNA構築物（プロモーター＋目的遺伝子）を雄性前核 male pronucleus 雄性前核（male pronucleus） male pronucleus（雄性前核） （より大きく可視化しやすい）へ直接注入する
3. 注入されたDNAはランダムな部位でゲノムへ組み込まれる（挿入部位insertion site 挿入部位（insertion site）insertion site（挿入部位） は制御できない）
4. 注入卵を偽妊娠させた仮親の卵管へ移植する
5. 生まれた仔（F0世代）のうちトランスジーンを持つものを、テールDNAのPCRPCR（polymerase chain reaction）/サザンブロットSouthern blot サザンブロット（Southern blot）Southern blot（サザンブロット） でスクリーニングする

⚠️ 前核注入法pronuclear injection 前核注入法（pronuclear injection）pronuclear injection（前核注入法） は挿入部位 insertion site 挿入部位（insertion site） insertion site（挿入部位） を制御できない。 これにより①コピー数 copy number コピー数（copy number） copy number（コピー数） が個体ごとに異なる（発現量のばらつき）、②挿入部位 insertion site 挿入部位（insertion site） insertion site（挿入部位） の内因性遺伝子を破壊する「挿入変異insertional mutation挿入変異（insertional mutation）insertional mutation（挿入変異）」が偶発的に起こりうる、という2つの限界を持つ。

ノックアウト技術

特定遺伝子の機能を完全に喪失させ、その遺伝子が生体内 in vivo 生体内（in vivo） in vivo（生体内） で担う役割を明らかにする手法。マウスのノックアウト knock-out ノックアウト（knock-out） knock-out（ノックアウト） は胚性幹細胞embryonic stem cell 胚性幹細胞（embryonic stem cell）embryonic stem cell（胚性幹細胞） （ES細胞 S cellS細胞（S cell） S cell（S細胞））を介した相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） （homologous recombination）により行われる。

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='target gene'>標的遺伝子</span>の両側に相同配列を持つ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='targeting vector'>ターゲティングベクター</span>を設計"] --> B["ベクター中央に選択マーカー（例：neo耐性遺伝子）を挿入し<span class='jp-term jp-term-diagram' title='target gene'>標的遺伝子</span>を破壊"]
  B --> C["E<span class='jp-term jp-term-diagram' title='S cell'>S細胞</span>へ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='electroporation'>エレクトロポレーション</span>で導入"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='homologous recombination'>相同組換え</span>が起こったE<span class='jp-term jp-term-diagram' title='S cell'>S細胞</span>のみを選択マーカーで選抜"]
  D --> E["選抜したE<span class='jp-term jp-term-diagram' title='S cell'>S細胞</span>を<span class='jp-term jp-term-diagram' title='blastocyst'>胚盤胞</span>へ注入"]
  E --> F["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='chimeric mouse'>キメラマウス</span>を作出"]
  F --> G["生殖系列にE<span class='jp-term jp-term-diagram' title='S cell'>S細胞</span>由来の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='mutant allele'>変異アレル</span>を持つ子孫（F1）を選抜"]
  G --> H["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='heterozygote'>ヘテロ接合体</span>同士を交配しホモ接合<span class='jp-term jp-term-diagram' title='knockout mouse'>ノックアウトマウス</span>を得る"]

1. 標的遺伝子target gene 標的遺伝子（target gene）target gene（標的遺伝子） の両側に相同な配列を持つターゲティングベクターtargeting vectorターゲティングベクター（targeting vector）targeting vector（ターゲティングベクター）を設計する——ベクター中央には標的遺伝子 target gene 標的遺伝子（target gene） target gene（標的遺伝子） のコード領域を破壊する形で選択マーカー（多くはネオマイシン neomycin ネオマイシン（neomycin） neomycin（ネオマイシン） 耐性遺伝子、neo）を挿入する
2. ターゲティングベクターtargeting vector ターゲティングベクター（targeting vector）targeting vector（ターゲティングベクター） をES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） へエレクトロポレーション electroporation エレクトロポレーション（electroporation） electroporation（エレクトロポレーション） で導入する
3. 相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） により内因性遺伝子が破壊されたES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） のみを、選択マーカーによる薬剤選抜（G418耐性等）で選び出す——相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） の頻度は非相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） よりはるかに低いため、正の選択positive selection 正の選択（positive selection）positive selection（正の選択） （neo耐性）と負の選択 negative selection 負の選択（negative selection） negative selection（負の選択） （例：単純ヘルペスウイルス herpes simplex virus, HSV 単純ヘルペスウイルス（herpes simplex virus, HSV） herpes simplex virus, HSV（単純ヘルペスウイルス） チミジンキナーゼ thymidine kinase チミジンキナーゼ（thymidine kinase） thymidine kinase（チミジンキナーゼ） 遺伝子によるガンシクロビルganciclovirガンシクロビル（ganciclovir）ganciclovir（ガンシクロビル）感受性）を組み合わせるダブルセレクションがよく用いられる
4. 選抜されたES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） を宿主胚盤胞 blastocyst 胚盤胞（blastocyst） blastocyst（胚盤胞） へ注入する→キメラマウスchimeric mouseキメラマウス（chimeric mouse）chimeric mouse（キメラマウス）（ES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） 由来組織と宿主胚由来組織が混在する個体）を作出する
5. キメラマウスchimeric mouse キメラマウス（chimeric mouse）chimeric mouse（キメラマウス） の生殖細胞がES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） 由来であるものを選び、これを交配してヘテロ接合体 heterozygote ヘテロ接合体（heterozygote） heterozygote（ヘテロ接合体） （F1）を得る
6. ヘテロ接合体heterozygote ヘテロ接合体（heterozygote）heterozygote（ヘテロ接合体） 同士を交配し、メンデルMendel メンデル（Mendel）Mendel（メンデル） 比に従いホモ接合ノックアウトマウス knockout mouse ノックアウトマウス（knockout mouse） knockout mouse（ノックアウトマウス） （1/4の頻度）を得る

⚠️ ES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） ＋相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） は「ゲノム編集genome editing ゲノム編集（genome editing）genome editing（ゲノム編集） 以前の標準法」であり、現在のノックアウトマウス knockout mouse ノックアウトマウス（knockout mouse） knockout mouse（ノックアウトマウス） 作製の主流はCRISPR/Cas9の受精卵 fertilized egg 受精卵（fertilized egg） fertilized egg（受精卵） 注入である。 従来法では多重変異マウスを得るのにES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） での逐次的な相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） か、単一変異マウス同士の時間のかかる交配が必要だった。これに対しCas9 mRNAとsgRNAを受精卵 fertilized egg 受精卵（fertilized egg） fertilized egg（受精卵） へ共注入する方法では、2遺伝子（Tet1・Tet2）の両アレル変異 biallelic mutation 両アレル変異（biallelic mutation） biallelic mutation（両アレル変異） を持つマウスが80%の効率で1段階で得られ、変異オリゴを同時に入れれば2遺伝子への点変異導入（＝ノックイン knock-inノックイン（knock-in） knock-in（ノックイン））まで1段階で行える¹。ES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） クローンの選抜・キメラchimeric キメラ（chimeric）chimeric（キメラ） 作出・生殖系列伝達の確認という工程が丸ごと不要になるため、所要期間が大幅に短縮された。上のES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） ルートは廃れたのではなく、条件付きアレル（floxed）の作製や、組換えを確認してから個体化したい場合に今も使われる——理解すべきなのは「相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） で狙い撃ちする」という原理そのものが、部位特異的ヌクレアーゼ（ZFN→TALEN→CRISPR/Cas9）で二本鎖切断 double-strand break 二本鎖切断（double-strand break） double-strand break（二本鎖切断） を狙った場所に作ることで飛躍的に効率化された、という流れである。ZFN・TALENは標的配列ごとにDNA結合タンパク質を設計し直す必要があったが、CRISPRはガイドRNARNA（ribonucleic acid）の20塩基を替えるだけで標的を変えられる点が決定的な違いだった。

コンディショナルノックアウト：Cre-loxPシステム

全身性のノックアウト knock-out ノックアウト（knock-out） knock-out（ノックアウト） が胎生致死 embryonic lethal 胎生致死（embryonic lethal） embryonic lethal（胎生致死） となる遺伝子の場合、特定の組織・発生段階developmental stages 発生段階（developmental stages）developmental stages（発生段階） でのみ遺伝子を欠失させるコンディショナルノックアウトconditional knockoutコンディショナルノックアウト（conditional knockout）conditional knockout（コンディショナルノックアウト）が用いられる。

• loxP配列（34 bpの特異的DNA配列）を標的遺伝子 target gene 標的遺伝子（target gene） target gene（標的遺伝子） の重要なエキソン exon エキソン（exon） exon（エキソン） の両側に挿入した「floxed（flanked by loxP）」マウスを作製する
• Cre組換え酵素を組織特異的プロモーターの制御下で発現するマウスと交配する
• Creが発現した組織でのみloxP配列間のDNAが切り出され、標的遺伝子target gene 標的遺伝子（target gene）target gene（標的遺伝子） が不活化される——他の組織では遺伝子は正常に機能する

⭐ Cre-loxPシステムの利点は「いつ・どこで」遺伝子を欠失させるかを制御できる点にある。 これにより発生初期に必須の遺伝子であっても、成体の特定組織でのみその機能を解析することが可能になる。

ノックイン技術

ノックアウトknock-out ノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト） が遺伝子の破壊であるのに対し、ノックインknock-in ノックイン（knock-in）knock-in（ノックイン） は内因性遺伝子座に新しい配列（変異アレルmutant allele変異アレル（mutant allele）mutant allele（変異アレル）、レポーター遺伝子、ヒト化配列など）を部位特異的に導入する技術である。機序はノックアウト knock-out ノックアウト（knock-out） knock-out（ノックアウト） と同様に相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） を利用するが、ターゲティングベクターtargeting vector ターゲティングベクター（targeting vector）targeting vector（ターゲティングベクター） が単に遺伝子を破壊するのではなく、置換したい配列（点変異、GFPなどのレポーター遺伝子、ヒト疾患変異アレル mutant allele 変異アレル（mutant allele） mutant allele（変異アレル） など）を運ぶ点が異なる。

• レポーターノックイン knock-in ノックイン（knock-in） knock-in（ノックイン） ： 内因性遺伝子座にGFP等のレポーター遺伝子を挿入し、内因性プロモーターの制御下でその遺伝子の発現パターンを可視化する
• 疾患モデルノックイン knock-in ノックイン（knock-in） knock-in（ノックイン） ： ヒト疾患の原因となる点変異をマウスの相同遺伝子座に導入し、より生理的な疾患モデルを作る（ランダム挿入のトランスジェニックより内因性の発現調節を保持する点で優れる）

💡 点変異ノックイン knock-in ノックイン（knock-in） knock-in（ノックイン） には「DNAを切らない」第2・第3世代がある。 相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） （HDR）による配列置換も、CRISPR/Cas9による切断＋HDRも、二本鎖切断double-strand break 二本鎖切断（double-strand break）double-strand break（二本鎖切断） を作るため意図しない挿入欠失（indel）を副産物として伴う。2016年の塩基編集base editing塩基編集（base editing）base editing（塩基編集）はCas9にシチジンデアミナーゼ cytidine deaminase シチジンデアミナーゼ（cytidine deaminase） cytidine deaminase（シチジンデアミナーゼ） を融合し、二本鎖切断double-strand break 二本鎖切断（double-strand break）double-strand break（二本鎖切断） もドナーDNAも用いずにC→T（G→A）置換を約5塩基の窓の中で起こす手法で、第2・第3世代では細胞DNAの約15〜75%を修正しながらindelを通常1%以下に抑える²。2019年のプライム編集prime editingプライム編集（prime editing）prime editing（プライム編集）は、切断活性を欠いたCas9に逆転写酵素を融合し、入れたい編集内容そのものを書き込んだpegRNAで導くことで、挿入・欠失・12種類すべての点変異を二本鎖切断 double-strand break 二本鎖切断（double-strand break） double-strand break（二本鎖切断） もドナーDNAもなしに導入する——HDRより高いか同等の効率で副産物が少なく、原理上は既知のヒト疾患関連変異の最大89%を修正しうるとされる³。相同組換えhomologous recombination 相同組換え（homologous recombination）homologous recombination（相同組換え） による古典的ノックイン knock-in ノックイン（knock-in） knock-in（ノックイン） が不要になったわけではないが、「1塩基だけ変えたい」ときの第一選択は切断を伴わないこの系統へ移りつつある。

ノックダウン技術

ノックアウトknock-outノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト）/ノックインknock-in ノックイン（knock-in）knock-in（ノックイン） が遺伝子そのものを永続的に改変するのに対し、ノックダウンknockdown ノックダウン（knockdown）knockdown（ノックダウン） は遺伝子を残したまま発現量を一時的・部分的に低下させる手法である。

💡 ノックダウンknockdown ノックダウン（knockdown）knockdown（ノックダウン） の利点は迅速性と可逆性である。 ノックアウトマウスknockout mouse ノックアウトマウス（knockout mouse）knockout mouse（ノックアウトマウス） の作製には数か月〜1年以上を要するが、siRNAトランスフェクション transfection トランスフェクション（transfection） transfection（トランスフェクション） によるノックダウン knockdown ノックダウン（knockdown） knockdown（ノックダウン） は数日で効果を評価でき、胎生致死embryonic lethal 胎生致死（embryonic lethal）embryonic lethal（胎生致死） 遺伝子でも成体組織で一過性に発現を下げて解析できる。ただし完全な発現消失（ヌル）は通常得られず、オフターゲットoff-target (effect) オフターゲット（off-target (effect)）off-target (effect)（オフターゲット） 効果のリスクも伴う。

クローニング：体細胞核移植

クローニングcloning クローニング（cloning）cloning（クローニング） とは、既存の個体と遺伝的に同一な個体を作出する技術であり、代表的な手法が体細胞核移植somatic cell nuclear transfer (SCNT)体細胞核移植（somatic cell nuclear transfer (SCNT)）somatic cell nuclear transfer (SCNT)（体細胞核移植）である（1996年のクローン羊ドリー、Dollyがその最初の哺乳類 mammal 哺乳類（mammal） mammal（哺乳類） での成功例）。

flowchart TD
  A["ドナー個体の体細胞（例：乳腺上皮細胞）を採取"] --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='unfertilized egg'>未受精卵</span>（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oocyte'>卵母細胞</span>）から核を除去（除核）"]
  C["体細胞（核を含む）を除核<span class='jp-term jp-term-diagram' title='oocyte'>卵母細胞</span>へ融合または注入"] --> D["電気パルスにより<span class='jp-term jp-term-diagram' title='cell fusion'>細胞融合</span>＋卵の活性化を誘導"]
  B --> C
  D --> E["体細胞由来の核が卵細胞質による初期化（reprogramming）を受ける"]
  E --> F["初期胚として発生開始→仮親の子宮へ移植"]
  F --> G["ドナー個体と同一の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nuclear genome'>核ゲノム</span>を持つクローン個体の誕生"]

1. ドナー個体の体細胞（乳腺上皮細胞など、分化した体細胞でよい）を採取する
2. 別個体から採取した未受精卵 unfertilized egg 未受精卵（unfertilized egg） unfertilized egg（未受精卵） 母細胞の核を吸引除去する（除核）
3. 体細胞（核を含む）を除核卵母細胞 oocyte 卵母細胞（oocyte） oocyte（卵母細胞） へ電気融合または顕微注入する
4. 電気パルスにより細胞融合 cell fusion 細胞融合（cell fusion） cell fusion（細胞融合） と卵の活性化（受精に類似した刺激）を同時に誘導する
5. 卵細胞質中の因子が体細胞由来の分化した核を初期化し、全能性totipotent 全能性（totipotent）totipotent（全能性） に近い状態へ巻き戻す
6. 初期化された核を持つ細胞が初期胚として発生を開始し、仮親の子宮へ移植される
7. 誕生した個体はドナー体細胞と同一の核ゲノム nuclear genome 核ゲノム（nuclear genome） nuclear genome（核ゲノム） を持つ（ミトコンドリアDNAmitochondrial DNA ミトコンドリアDNA（mitochondrial DNA）mitochondrial DNA（ミトコンドリアDNA） は卵提供個体由来のため完全に同一ではない）

⚠️ SCNTクローンの成功率は低く、テロメア短縮telomere shortening テロメア短縮（telomere shortening）telomere shortening（テロメア短縮） や遺伝子発現異常などの初期化不全に起因する健康上の問題（早期老化、肥満、免疫異常など）が報告されている。 これは体細胞の核が本来持っていたエピジェネティック epigenetic エピジェネティック（epigenetic） epigenetic（エピジェネティック） な修飾（DNAメチル化パターン等、22-epigenetic-regulation-of-eukaryotic-transcription-the-role-of-dna-methylation参照）が、卵細胞質による初期化過程で完全には消去されないことに一因があると考えられている。

医学・生物学的応用のまとめ

まとめ

• トランスジェニック動物transgenic animal トランスジェニック動物（transgenic animal）transgenic animal（トランスジェニック動物） は前核注入 pronuclear injection 前核注入（pronuclear injection） pronuclear injection（前核注入） によりランダムな部位へ外来遺伝子を導入するが、挿入部位insertion site 挿入部位（insertion site）insertion site（挿入部位） を制御できないため発現量のばらつきや挿入変異 insertional mutation 挿入変異（insertional mutation） insertional mutation（挿入変異） のリスクを伴う。
• ノックアウトknock-out ノックアウト（knock-out）knock-out（ノックアウト） はES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） での相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） とキメラマウス chimeric mouse キメラマウス（chimeric mouse） chimeric mouse（キメラマウス） 作出により内因性遺伝子を破壊する手法であり、Cre-loxPシステムを用いたコンディショナルノックアウト conditional knockout コンディショナルノックアウト（conditional knockout） conditional knockout（コンディショナルノックアウト） により組織特異的・時期特異的な遺伝子欠失が可能になる。
• ノックインknock-in ノックイン（knock-in）knock-in（ノックイン） は相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） を利用して内因性遺伝子座に新規配列（変異アレルmutant allele変異アレル（mutant allele）mutant allele（変異アレル）、レポーター遺伝子）を部位特異的に導入する点でノックアウト knock-out ノックアウト（knock-out） knock-out（ノックアウト） と区別される。
• 作製手段は世代交代している——ES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） での相同組換え homologous recombination 相同組換え（homologous recombination） homologous recombination（相同組換え） はCRISPR/Cas9の受精卵 fertilized egg 受精卵（fertilized egg） fertilized egg（受精卵） 注入（1段階・両アレル80%）に主流を譲り、点変異の導入にはさらに二本鎖切断 double-strand break 二本鎖切断（double-strand break） double-strand break（二本鎖切断） を伴わない塩基編集 base editors 塩基編集（base editors） base editors（塩基編集） （2016年）とプライム編集（2019年）が加わった。ただし条件付きアレル作製など、ES細胞 S cell S細胞（S cell） S cell（S細胞） ルートが今も使われる場面は残る。
• ノックダウンknockdown ノックダウン（knockdown）knockdown（ノックダウン） （RNAi、アンチセンスオリゴヌクレオチドAntisense oligonucleotide, ASOアンチセンスオリゴヌクレオチド（Antisense oligonucleotide, ASO）Antisense oligonucleotide, ASO（アンチセンスオリゴヌクレオチド）、モルフォリノmorpholinoモルフォリノ（morpholino）morpholino（モルフォリノ））は遺伝子を破壊せず発現量を一時的に低下させる、迅速かつ可逆的な代替アプローチである。
• 体細胞核移植somatic cell nuclear transfer (SCNT) 体細胞核移植（somatic cell nuclear transfer (SCNT)）somatic cell nuclear transfer (SCNT)（体細胞核移植） によるクローニング cloning クローニング（cloning） cloning（クローニング） は、分化した体細胞の核を除核卵母細胞 oocyte 卵母細胞（oocyte） oocyte（卵母細胞） の細胞質で初期化することにより、ドナーと同一の核ゲノム nuclear genome 核ゲノム（nuclear genome） nuclear genome（核ゲノム） を持つ個体を作出する技術であり、初期化不全による健康上の課題を抱える。