ヒト遺伝子治療の原理（in vivo法とex vivo法、遺伝子付加、CRISPR/Cas9システム）（EM学生のみ）

🧠 遺伝子治療の全戦略は「治療用遺伝子をどこで細胞に入れるか（体内 in vivo か、体外 ex vivo か）」と「どう運ぶか（ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター） vs 非ウイルスベクターNon-viral vectors非ウイルスベクター（Non-viral vectors）Non-viral vectors（非ウイルスベクター））」という2つの軸の組み合わせで整理できる。 CRISPR/Cas9は、この運搬問題とは独立した「編集そのものの精密さ」を提供する技術であり、細菌が獲得したウイルスへの適応免疫 adaptive 適応免疫（adaptive） adaptive（適応免疫） 記憶（CRISPR配列）を、Cas9という分子のハサミを導くガイドRNARNA（ribonucleic acid）として転用したものである。

遺伝子治療とは

遺伝子治療とは、疾患を治療または予防するために遺伝子を用いる技術である。

⚠️ 「実験的技術」という位置づけは既に古い。 遺伝子治療は臨床試験 clinical trial (clinical study) 臨床試験（clinical trial (clinical study)） clinical trial (clinical study)（臨床試験） 段階の技術ではなく、規制当局regulatory agency 規制当局（regulatory agency）regulatory agency（規制当局） が承認した医薬品として市販 marketing 市販（marketing） marketing（市販） されている治療法である。2024年時点で米国FDAFDA（Food and Drug Administration）が承認した遺伝子治療は20品目を超え¹、そのうちAAVベクター adeno-associated virus (AAV) vector AAVベクター（adeno-associated virus (AAV) vector） adeno-associated virus (AAV) vector（AAVベクター） を用いた製品だけで7品目が各国で承認されている²。⭐ ただし現時点で最も高価な医薬品群でもあり、定価が患者1人あたり400万米ドルを超える製品がある¹——普及の律速は技術ではなく費用と製造能力に移りつつある。

一般的戦略：

• 疾患の遺伝的原因 genetic origin 遺伝的原因（genetic origin） genetic origin（遺伝的原因） を同定する
• 実験室でその問題への遺伝的な修正法を作る
• この遺伝的修正を病気の患者体内の細胞へ導入する送達システムを設計する

生体内遺伝子治療

遺伝子が患者の体内にいる状態のまま細胞へ導入される。

• 個々の細胞をin vitroで十分な数まで培養できない場合（例：脳細胞）に適用される
• 培養した（治療用）細胞を効率的に移植/再移植できない場合に必要となる

ex vivo遺伝子治療

修正対象患者からの細胞単離→細胞培養 cell culture 細胞培養（cell culture） cell culture（細胞培養） →治療用遺伝子の導入→遺伝的に修正された細胞の選択・培養→修正された細胞を患者へ移植。

💡 承認済み製品を「in vivo型」「ex vivo型」の2列に振り分けて覚えると、この2軸がそのまま実物の分類になる。

⭐ in vivo型はAAV、ex vivo型は造血幹細胞、という組み合わせが実際の製品では圧倒的に多い。理由は本ノートの定義そのもの——造血幹細胞は体外へ取り出して培養し骨髄へ戻せるが、網膜色素上皮細胞retinal pigment epithelial cell 網膜色素上皮細胞（retinal pigment epithelial cell）retinal pigment epithelial cell（網膜色素上皮細胞） や運動ニューロンはそれができないので、ベクターを体内へ入れるしかない。

遺伝子治療のベクター

ベクターは治療用遺伝子を標的細胞 target cell 標的細胞（target cell） target cell（標的細胞） へ移すために必要な運び手である。2つの主要な型がある：ウイルスベクターviral vectorsウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター）と非ウイルスベクターNon-viral vectors非ウイルスベクター（Non-viral vectors）Non-viral vectors（非ウイルスベクター）。

ウイルスベクター

ウイルスが細胞に感染することで新規遺伝子を送達するが、疾患を引き起こさないよう改変されている。最も効果的だが、その免疫原性 immunogenicity免疫原性（immunogenicity） immunogenicity（免疫原性）・発癌性carcinogenicity発癌性（carcinogenicity）carcinogenicity（発癌性）・DNADNA（deoxyribonucleic acid）サイズの小ささにより制限を受ける。

⚠️ AAVベクターadeno-associated virus (AAV) vector AAVベクター（adeno-associated virus (AAV) vector）adeno-associated virus (AAV) vector（AAVベクター） の表の記述は3点で危険な誤りを含む。 教科書に残りやすい古い記述なので、次の3点は必ず訂正して覚えること。

1. 「染色体19番へ組み込み」は野生型AAVの話で、治療用の組換えAAV（rAAV）には当てはまらない。 部位特異的組み込みにはrep遺伝子が必要だが、rAAVではrep/capを導入遺伝子に置き換えてあるため、この機能が失われている。あらゆる文脈でAAVの組み込みは非効率であり、組織中でのrAAVの残存はほとんどエピソーム episome エピソーム（episome） episome（エピソーム） （染色体外）のゲノムによる⁸。核内でrAAVゲノムは主にエピソーム episome エピソーム（episome） episome（エピソーム） 型で存在するので、非分裂細胞ほど安定に形質導入 transduction 形質導入（transduction） transduction（形質導入） される（分裂すると希釈されて失われる）⁹。組み込みは低頻度に起こるが部位特異的ではない。
2. 「免疫応答なし」は明確に誤り。 AAVカプシド capsid カプシド（capsid） capsid（カプシド） に対する中和抗体neutralizing antibodies中和抗体（neutralizing antibodies）neutralizing antibodies（中和抗体）は健常人にもあらかじめ存在し、多くの臨床試験 clinical trial (clinical study) 臨床試験（clinical trial (clinical study)） clinical trial (clinical study)（臨床試験） が中和抗体価 neutralizing antibody titer 中和抗体価（neutralizing antibody titer） neutralizing antibody titer（中和抗体価） で被験者 study participant / subject 被験者（study participant / subject） study participant / subject（被験者） を選別している（255試験のメタ解析 Meta-analysis メタ解析（Meta-analysis） Meta-analysis（メタ解析） で38.7%が中和抗体 neutralizing antibodies 中和抗体（neutralizing antibodies） neutralizing antibodies（中和抗体） アッセイを使用、46.3%が免疫抑制薬 immunosuppressant 免疫抑制薬（immunosuppressant） immunosuppressant（免疫抑制薬） を併用）¹⁰。導入遺伝子が免疫原性 immunogenicity 免疫原性（immunogenicity） immunogenicity（免疫原性） を持つ場合には発現がより大きく減衰する¹¹。近年は高用量投与での補体活性化complement activation補体活性化（complement activation）complement activation（補体活性化）も問題になっている¹²。
3. 用量依存性Dose-related 用量依存性（Dose-related）Dose-related（用量依存性） の重篤毒性がある。 とくに1×10¹⁴ vg/kgを超える全身投与で、急性の免疫反応・肝毒性・血栓性微小血管症thrombotic microangiopathy, TMA 血栓性微小血管症（thrombotic microangiopathy, TMA）thrombotic microangiopathy, TMA（血栓性微小血管症） （TMATMA, thrombotic microangiopathy）が起こりうる¹³。オナセムノゲンonasemnogeneオナセムノゲン（onasemnogene）onasemnogene（オナセムノゲン） アベパルボベク（1.1×10¹⁴ vg/kg静注）では血清トランスアミナーゼ serum transaminases 血清トランスアミナーゼ（serum transaminases） serum transaminases（血清トランスアミナーゼ） 上昇が高頻度にみられ、重篤な急性肝障害 acute liver injury 急性肝障害（acute liver injury） acute liver injury（急性肝障害） の報告もあるため予防的プレドニゾロン prednisolone プレドニゾロン（prednisolone） prednisolone（プレドニゾロン） 投与が標準化されている¹⁴。255試験のメタ解析 Meta-analysis メタ解析（Meta-analysis） Meta-analysis（メタ解析） では8試験で計11例の死亡があり、臨床試験clinical trial (clinical study) 臨床試験（clinical trial (clinical study)）clinical trial (clinical study)（臨床試験） 中断30件のうち18件が毒性所見によるものだった¹⁰。⭐ 「AAV＝安全なベクター」という一言で終わらせず、「野生型は非病原性 apathogenic 非病原性（apathogenic） apathogenic（非病原性） だが、治療に必要な高用量では別物」と理解する。

⚠️ レトロウイルス（γレトロウイルス）ベクターの最大の問題は挿入変異 insertional mutation 挿入変異（insertional mutation） insertional mutation（挿入変異） による白血病である。 X連鎖重症複合免疫不全症 severe combined immunodeficiency 重症複合免疫不全症（severe combined immunodeficiency） severe combined immunodeficiency（重症複合免疫不全症） （SCID-X1）に対するγレトロウイルスベクター Retrovirus vectors レトロウイルスベクター（Retrovirus vectors） Retrovirus vectors（レトロウイルスベクター） を用いたex vivo遺伝子治療では、10人の被験者 study participant / subject 被験者（study participant / subject） study participant / subject（被験者） の中からクローン性のT細胞性急性リンパ性白血病 acute lymphoblastic leukemia, ALL 急性リンパ性白血病（acute lymphoblastic leukemia, ALL） acute lymphoblastic leukemia, ALL（急性リンパ性白血病） （T-ALLALL（acute lymphoblastic leukemia））が発生した。原因は、ベクターが癌原遺伝子 Proto-oncogene 癌原遺伝子（Proto-oncogene） Proto-oncogene（癌原遺伝子） LMO2の上流35 kbの位置にアンチセンス antisense アンチセンス（antisense） antisense（アンチセンス） 方向に組み込まれ、白血病クローンでLMO2が過剰発現 overexpression 過剰発現（overexpression） overexpression（過剰発現） したことである（さらにNOTCH1の機能獲得変異 gain-of-function mutation機能獲得変異（gain-of-function mutation） gain-of-function mutation（機能獲得変異）・CDKN2A欠失などの二次的遺伝子異常が加わって白血病化した）¹⁵。⭐ この事故が「γレトロウイルスのエンハンサー enhancer エンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー） は本質的に毒性を持つ」という認識をもたらし、現在は自己不活性化（SIN）型のレンチウイルスベクター Lentivirus vectors レンチウイルスベクター（Lentivirus vectors） Lentivirus vectors（レンチウイルスベクター） へ置き換わっている。トピック34の「MLVは転写開始 transcription initiation 転写開始（transcription initiation） transcription initiation（転写開始） 点近傍を好んで組み込まれる」という部位選択の偏りが、そのまま臨床事故の分子的原因になっている。

非ウイルスベクター

ウイルスベクターviral vectors ウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター） より毒性・免疫原性immunogenicity 免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性） が低いベクター。より安全で再現性が高く、DNAサイズの制限がない。

遺伝子送達の方法：

物理的方法：遺伝子銃（gene gun、元々は植物形質転換用に設計、外来DNA（トランスジーン）を細胞へ送達するために重金属 heavy metals 重金属（heavy metals） heavy metals（重金属） の微粒子（金、DNAでコーティング）を用いる）、マイクロインジェクションmicroinjectionマイクロインジェクション（microinjection）microinjection（マイクロインジェクション）、エレクトロポレーションelectroporationエレクトロポレーション（electroporation）electroporation（エレクトロポレーション）。

化学的方法：界面活性剤 surfactant 界面活性剤（surfactant） surfactant（界面活性剤） 混合物（リン酸カルシウムcalcium phosphate リン酸カルシウム（calcium phosphate）calcium phosphate（リン酸カルシウム） -cDNA混合物——細胞膜が乱され孔径 pore size 孔径（pore size） pore size（孔径） が広がりcDNAが細胞内へ入る）、リポフェクションlipofection リポフェクション（lipofection）lipofection（リポフェクション） （人工リン脂質小胞であるリポソーム liposome リポソーム（liposome） liposome（リポソーム） を用いてDNAを細胞内へ入れる）。

遺伝子付加

目標： 遺伝子の機能喪失により引き起こされる疾患の場合→正常な遺伝子産物量を、正常な表現型が回復するレベルまで増加させる。

• 遺伝子治療の最も一般的な形式
• 病態形成（疾患の発生）が可逆的な疾患のみに適用可能
• 特に常染色体劣性疾患 autosomal recessive disorder 常染色体劣性疾患（autosomal recessive disorder） autosomal recessive disorder（常染色体劣性疾患） に応用される——導入された遺伝子のわずかな発現レベルでも大きな違いを生みうるため
• 例：導入遺伝子の機能的コピー functional copy 機能的コピー（functional copy） functional copy（機能的コピー） を導入することで疾患を修正する嚢胞性線維症などの機能喪失疾患の治療に用いられうる

CRISPR/Cas9システム

CRISPR/Cas9システムは、ゲノムの一部を編集するために用いられる技術であり、CRISPR部分がCas9酵素（分子のハサミ）を標的DNA区間へ導く。その後、両者が協働して遺伝子を不活性化/修復するか、Cas9のハサミが切断を加えた場所に新しいものを挿入する。

CRISPR： クラスターcluster クラスター（cluster）cluster（クラスター） 化して規則的に間隔配置された短い回文配列 palindromic sequence回文配列（palindromic sequence） palindromic sequence（回文配列） Cas9： CRISPR関連ヌクレアーゼ9（CRISPR associated nuclease 9）

反復配列repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence）repetitive sequence（反復配列） は部分的に回文 palindrome (palindromic sequence) 回文（palindrome (palindromic sequence)） palindrome (palindromic sequence)（回文） 構造をとる短い反復配列 repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence） repetitive sequence（反復配列） で、大腸菌（細菌）ゲノム中にスペーサー spacer スペーサー（spacer） spacer（スペーサー） （短い統合ウイルスDNA）を間に挟んで見出される。実測では大腸菌のI-E型CRISPRの反復配列 repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence） repetitive sequence（反復配列） は26〜32 bp、I-F型は28 bp、スペーサーspacer スペーサー（spacer）spacer（スペーサー） は29〜35 bpで、1菌株あたりのスペーサー spacer スペーサー（spacer） spacer（スペーサー） 数は1〜47個と幅がある¹⁶（「20〜25 bp」とする記述は短すぎる）。このシステムはウイルス感染に対する遺伝的記憶素子——外来遺伝要素に対する適応免疫 adaptive 適応免疫（adaptive） adaptive（適応免疫） ——を持つ細菌に由来する。これらは2回目の感染時にウイルスを検出・破壊する。

機序

免疫化フェーズ： 細菌がウイルスに初めて遭遇したとき

• 攻撃するウイルスが細菌細胞 bacteria 細菌細胞（bacteria） bacteria（細菌細胞） 内へDNAを注入する
• 細菌はウイルスDNAを捕獲 capture (electron/neutron capture) 捕獲（capture (electron/neutron capture)） capture (electron/neutron capture)（捕獲） し、Cas1・Cas2と呼ばれるタンパク質により切断する（切断はPAM配列——プロトスペーサー protospacer (as in PAM, protospacer adjacent motif) プロトスペーサー（protospacer (as in PAM, protospacer adjacent motif)） protospacer (as in PAM, protospacer adjacent motif)（プロトスペーサー） 隣接モチーフ——で起こる）
• 切断されたDNA断片はCRISPR座位にスペーサー spacer スペーサー（spacer） spacer（スペーサー） として組み込まれる→crRNA（CRISPR RNA）を作る
• 構造：反復配列 repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence） repetitive sequence（反復配列） ｜スペーサー spacer スペーサー（spacer） spacer（スペーサー） ｜反復配列 repetitive sequence 反復配列（repetitive sequence） repetitive sequence（反復配列） ｜スペーサー spacerスペーサー（spacer） spacer（スペーサー）…と続く

攻撃ウイルスDNAの不活性化フェーズ： 細菌がウイルスに2回目に遭遇したとき

flowchart TD
  A["細菌ゲノムからCRISPR <span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>の転写"] --> B["トランス活性化<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>がpre-CRISPR <span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>配列と<span class='jp-term jp-term-diagram' title='base pairing'>塩基対合</span>→<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>二<span class='jp-term jp-term-diagram' title='heavy chain'>重鎖</span>形成"]
  B --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>二<span class='jp-term jp-term-diagram' title='heavy chain'>重鎖</span>が切断されトランス活性化<span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>とCRISPR <span class='jp-term jp-term-diagram' title='ribonucleic acid'>RNA</span>の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hybrid'>ハイブリッド</span>を形成"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='hybrid'>ハイブリッド</span>が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='endonuclease'>エンドヌクレアーゼ</span>Cas9のガイドとして機能"]
  D --> E["Cas9が侵入核酸を切断→ウイルス遺伝子を沈黙化"]

• 細菌ゲノムからCRISPR RNAの転写が起こる
• トランス活性化RNAがpre-CRISPR RNA配列に相補的で塩基対合 base pairing 塩基対合（base pairing） base pairing（塩基対合） する→RNA二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） を形成
• RNA二重鎖 heavy chain 重鎖（heavy chain） heavy chain（重鎖） が切断されトランス活性化RNAとCRISPR RNAのハイブリッド hybrid ハイブリッド（hybrid） hybrid（ハイブリッド） を形成する
• このハイブリッド hybrid ハイブリッド（hybrid） hybrid（ハイブリッド） がエンドヌクレアーゼ endonucleaseエンドヌクレアーゼ（endonuclease） endonuclease（エンドヌクレアーゼ）Cas9のガイドとして機能し、侵入核酸を切断する→ウイルス遺伝子を沈黙化させる

⚠️ CRISPRはもう「将来の技術」ではない——2023年末に承認薬になった。 Casgevy（エクサガムグロゲン アウトテムセル、exa-cel）が世界初のCRISPR/Cas9ゲノム編集 genome editing ゲノム編集（genome editing） genome editing（ゲノム編集） 治療薬として、2023年11月16日に英国MHRAMHRA（Medicines and Healthcare products Regulatory Agency）、2023年12月8日に米国FDA、2023年12月15日に欧州EMAの承認を受けた¹⁷。方式は本ノートの分類でいうex vivo：患者自身のCD34⁺造血幹・前駆細胞を体外に取り出し、CRISPR/Cas9でBCL11Aの赤血球特異的エンハンサー enhancer エンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー） 領域を切断して胎児ヘモグロビン fetal hemoglobin (HbF) 胎児ヘモグロビン（fetal hemoglobin (HbF)） fetal hemoglobin (HbF)（胎児ヘモグロビン） 合成の抑制を外し、ブスルファンbusulfan ブスルファン（busulfan）busulfan（ブスルファン） による骨髄破壊的前処置 myeloablative conditioning 骨髄破壊的前処置（myeloablative conditioning） myeloablative conditioning（骨髄破壊的前処置） ののち輸注する⁶⁷。⭐ 遺伝子「付加」ではなく、抑制因子repressor 抑制因子（repressor）repressor（抑制因子） の結合部位を壊して眠っていた遺伝子（HBG）を起こすという点で、本ノートの「遺伝子付加gene augmentation遺伝子付加（gene augmentation）gene augmentation（遺伝子付加）」とは別戦略であることに注意。

💡 Cas9のハサミ（二本鎖切断double-strand break二本鎖切断（double-strand break）double-strand break（二本鎖切断））を使わない第2・第3世代の編集技術がある。 二本鎖切断double-strand break 二本鎖切断（double-strand break）double-strand break（二本鎖切断） は細胞のDNA損傷応答を引き起こしてランダムなインデル indel インデル（indel） indel（インデル） を大量に作るため、点変異の修正には不向きだった。そこで開発されたのが次の2つで、いずれも切断能を落としたCas9を「配列を探す装置」としてだけ使い、書き換えは融合させた酵素が行う。

⭐ プライム編集は「Cas9で場所を探し、逆転写酵素でpegRNAに書かれた新しい配列を書き写す」——トピック34のレトロウイルスと同じ逆転写酵素が、今度は治療の道具 tool 道具（tool） tool（道具） として使われているのが面白いところ。

まとめ

• 遺伝子治療は生体内 in vivo 生体内（in vivo） in vivo（生体内） （患者体内で直接導入）とex vivo（細胞を単離・培養・修正後に移植）の2方式に大別され、ウイルスベクターviral vectors ウイルスベクター（viral vectors）viral vectors（ウイルスベクター） （レトロウイルス・アデノウイルスAdenovirusアデノウイルス（Adenovirus）Adenovirus（アデノウイルス）・AAV・HSVHSV（herpes simplex virus）、それぞれ組み込み能・免疫原性immunogenicity免疫原性（immunogenicity）immunogenicity（免疫原性）・搭載サイズが異なる）と非ウイルスベクター Non-viral vectors 非ウイルスベクター（Non-viral vectors） Non-viral vectors（非ウイルスベクター） （リポプレックスlipoplexリポプレックス（lipoplex）lipoplex（リポプレックス）、DNA分子複合体、人工染色体）を用いて遺伝子を送達する。
• 遺伝子付加gene augmentation 遺伝子付加（gene augmentation）gene augmentation（遺伝子付加） は機能喪失疾患（特に常染色体劣性疾患 autosomal recessive disorder常染色体劣性疾患（autosomal recessive disorder） autosomal recessive disorder（常染色体劣性疾患））に対し正常遺伝子産物を補充する最も一般的な遺伝子治療形式である。
• CRISPR/Cas9は細菌の適応免疫 adaptive 適応免疫（adaptive） adaptive（適応免疫） 機構（CRISPR座位へのウイルスDNAスペーサー spacer スペーサー（spacer） spacer（スペーサー） 獲得）に由来し、crRNA-Cas9複合体が標的DNAを配列特異的に切断することでゲノム編集 genome editing ゲノム編集（genome editing） genome editing（ゲノム編集） を可能にする。2023年末にex vivo型のCasgevy（exa-cel）が世界初のCRISPR承認薬となり、二本鎖切断double-strand break 二本鎖切断（double-strand break）double-strand break（二本鎖切断） を使わない塩基編集 base editors塩基編集（base editors） base editors（塩基編集）・プライム編集が後続世代として実用化されつつある。
• ⚠️ 安全性の要点：γレトロウイルスベクター Retrovirus vectors レトロウイルスベクター（Retrovirus vectors） Retrovirus vectors（レトロウイルスベクター） は癌原遺伝子 Proto-oncogene 癌原遺伝子（Proto-oncogene） Proto-oncogene（癌原遺伝子） 近傍への挿入変異 insertional mutation 挿入変異（insertional mutation） insertional mutation（挿入変異） で白血病を起こしうる（SCID-X1試験のLMO2）。AAVベクターadeno-associated virus (AAV) vector AAVベクター（adeno-associated virus (AAV) vector）adeno-associated virus (AAV) vector（AAVベクター） は組換え体では主にエピソーム episome エピソーム（episome） episome（エピソーム） として残り部位特異的には組み込まれず、中和抗体neutralizing antibodies中和抗体（neutralizing antibodies）neutralizing antibodies（中和抗体）・補体活性化complement activation 補体活性化（complement activation）complement activation（補体活性化） などの免疫応答と、高用量（>1×10¹⁴ vg/kg）での肝毒性・血栓性微小血管症thrombotic microangiopathy, TMA 血栓性微小血管症（thrombotic microangiopathy, TMA）thrombotic microangiopathy, TMA（血栓性微小血管症） という用量依存性 Dose-related 用量依存性（Dose-related） Dose-related（用量依存性） 毒性を持つ。