in vitro転写・翻訳

🧠 この実験は「生きた細胞を使わずにタンパク質を作る」という無細胞タンパク質合成 cell-free protein synthesis 無細胞タンパク質合成（cell-free protein synthesis） cell-free protein synthesis（無細胞タンパク質合成） の実演であり、真核生物の通常のmRNA成熟過程（キャップ形成cappingキャップ形成（capping）capping（キャップ形成）・スプライシング・ポリアデニル化polyadenylationポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化））を、それぞれ人工的な代替物で置き換えるという発想で成り立つ。 キャップの代わりにGAAトリプレット+タバコ tobacco タバコ（tobacco） tobacco（タバコ） モザイクウイルスエンハンサー enhancer エンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー） 配列、ポリA鎖の代わりに長い3’非翻訳領域 untranslated region非翻訳領域（untranslated region） untranslated region（非翻訳領域）、スプライシングの代わりにあらかじめイントロンを除いたcDNAを使う——生細胞が担っていた「品質保証quality assurance (QA)品質保証（quality assurance (QA)）quality assurance (QA)（品質保証）」の役割を、化学的に安定な代替配列に肩代わりさせることで、試験管の中だけで転写と翻訳を完結させる。

転写

真核生物におけるmRNA成熟には、キャップ形成cappingキャップ形成（capping）capping（キャップ形成）、スプライシング、ポリアデニル化polyadenylationポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化）が含まれる（16-processing-of-the-eukaryotic-mrna参照）。しかしin vitro転写アッセイにはRNAプロセシング因子が存在しない。したがって、これら3つの過程はそれぞれ人工的な代替物で置き換えられる：

• キャップなし： メチルグアノシンキャップmethylguanosine cap メチルグアノシンキャップ（methylguanosine cap）methylguanosine cap（メチルグアノシンキャップ） は、mRNA中でGAAトリプレットとそれに続くタバコ tobacco タバコ（tobacco） tobacco（タバコ） モザイクウイルスエンハンサー enhancer エンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー） （オメガ）配列に置き換えられうる
• ポリA鎖なし： 終止コドンstop codon 終止コドン（stop codon）stop codon（終止コドン） の下流に位置する長い3’非翻訳領域 untranslated region 非翻訳領域（untranslated region） untranslated region（非翻訳領域） が、mRNAの安定性を大幅に改善しうる
• スプライシングなし： 目的遺伝子のcDNA（コピーDNA）がベクターにクローニング cloning クローニング（cloning） cloning（クローニング） される

💡 オメガ配列の正体は「TMVの5’リーダー reader リーダー（reader） reader（リーダー） 67塩基」である。 バクテリオファージbacteriophage バクテリオファージ（bacteriophage）bacteriophage（バクテリオファージ） SP6プロモーターとレポーター遺伝子の間にこの67ヌクレオチドを挟むと、5’キャップの有無にかかわらず翻訳量が2〜10倍に増える¹。キャップが無くても効くという点がまさに「キャップの代わり」たりうる理由であり、オメガ配列はキャップ依存的な開始経路を迂回させる翻訳エンハンサー enhancer エンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー） として働く。

💡 転写を回すのはバクテリオファージ bacteriophage バクテリオファージ（bacteriophage） bacteriophage（バクテリオファージ） 由来のRNAポリメラーゼである。 in vitro転写では、SP6・T7・T3といったファージのRNAポリメラーゼと、それに対応する短い特異的プロモーター配列 promoter sequence プロモーター配列（promoter sequence） promoter sequence（プロモーター配列） だけで転写が始まる¹。真核生物のRNAポリメラーゼII RNA polymerase II RNAポリメラーゼII（RNA polymerase II） RNA polymerase II（RNAポリメラーゼII） のように多数の基本転写因子から成る前開始複合体 pre-initiation complex (PIC) 前開始複合体（pre-initiation complex (PIC)） pre-initiation complex (PIC)（前開始複合体） を組む必要がないため、試験管内in vitro 試験管内（in vitro）in vitro（試験管内） で成立する。前段のクローニング cloning クローニング（cloning） cloning（クローニング） で使うベクター（pEU-E01系）がSP6プロモーターを持つのはこのためである。

翻訳

無細胞タンパク質合成cell-free protein synthesis 無細胞タンパク質合成（cell-free protein synthesis）cell-free protein synthesis（無細胞タンパク質合成） ：

• 生きた細胞を用いずに試験管内 in vitro 試験管内（in vitro） in vitro（試験管内） でタンパク質を合成する
• 翻訳に必要な要素：リボソーム、mRNA、アミノアシルtRNAaminoacyl-tRNAアミノアシルtRNA（aminoacyl-tRNA）aminoacyl-tRNA（アミノアシルtRNA）、アミノ酸

→ GFP＝ 緑色蛍光タンパク質（実験室でマーカーとして用いられる）。

翻訳反応

コムギ胚芽抽出液wheat germ extractコムギ胚芽抽出液（wheat germ extract）wheat germ extract（コムギ胚芽抽出液）はリボソーム、RNA類、翻訳因子、アミノアシルtRNA合成酵素aminoacyl-tRNA synthetaseアミノアシルtRNA合成酵素（aminoacyl-tRNA synthetase）aminoacyl-tRNA synthetase（アミノアシルtRNA合成酵素）、エネルギー源を含む。

• 基質： アミノ酸基質
• 翻訳の鋳型： mRNA（in vitroで合成されたもの）
• 二層epiblast/hypoblast 二層（epiblast/hypoblast）epiblast/hypoblast（二層） 構造（バイレイヤー法bilayer methodバイレイヤー法（bilayer method）bilayer method（バイレイヤー法））： 翻訳混合液の上に基質混合液を重ね、その界面を通じて基質を連続的に供給し、小さな副産物を連続的に除去する
• 陰性対照： もう1本の試験管にはRNAポリメラーゼを含めない（mRNAが合成されないので蛋白質もできない）

⚠️ 「二層epiblast/hypoblast二層（epiblast/hypoblast）epiblast/hypoblast（二層）」は対照実験のことではなく、収量を上げるための反応形式の名前である。 コムギ胚芽無細胞系で使われる二層 epiblast/hypoblast 二層（epiblast/hypoblast） epiblast/hypoblast（二層） （バイレイヤー）法は、翻訳混合液と基質混合液という2つの層を1つのウェル／試験管の中で重ね、その間の拡散によって基質の供給と副産物の除去を続ける仕組みで、同じ系のバッチ反応の10倍を超える蛋白質収量が得られる²。RNAポリメラーゼを抜いた試験管は、これとは別に置く陰性対照である。この2つを混同しない。

💡 無細胞翻訳系はコムギ胚芽だけではない。 代表的な3つはウサギ網赤血球ライセートrabbit reticulocyte lysateウサギ網赤血球ライセート（rabbit reticulocyte lysate）rabbit reticulocyte lysate（ウサギ網赤血球ライセート）・コムギ胚芽抽出液wheat germ extractコムギ胚芽抽出液（wheat germ extract）wheat germ extract（コムギ胚芽抽出液）・大腸菌抽出液で、同じmRNAをどれでも翻訳できる¹。コムギ胚芽系は真核型の翻訳装置を持ちながら内在mRNAが少なく、長時間安定に働くため、二層epiblast/hypoblast 二層（epiblast/hypoblast）epiblast/hypoblast（二層） 法と組み合わせた大量合成・ハイスループット解析に向く²。

flowchart TD
  A["cDNA（イントロンなし）をベクターへ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='cloning'>クローニング</span>"] --> B["in vitro転写：<span class='jp-term jp-term-diagram' title='bacteriophage'>バクテリオファージ</span>RNAポリメラーゼ"]
  B --> C["GAAトリプレット+<span class='jp-term jp-term-diagram' title='enhancer'>エンハンサー</span>配列（キャップの代替）+長い3'UTR（ポリAの代替）を持つmRNA"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='wheat germ extract'>コムギ胚芽抽出液</span>（リボソーム・tRNA・翻訳因子・アミノ酸）との<span class='jp-term jp-term-diagram' title='epiblast/hypoblast'>二層</span>構成"]
  D --> E["インキュベートによる翻訳"]
  E --> F["GFPの産生→誘導光発光による検出"]

まとめ

• in vitro転写では、真核生物の通常のmRNA成熟過程（キャップ形成cappingキャップ形成（capping）capping（キャップ形成）、スプライシング、ポリアデニル化polyadenylationポリアデニル化（polyadenylation）polyadenylation（ポリアデニル化））がRNAプロセシング因子の非存在下で行われるため、GAAトリプレット+タバコ tobacco タバコ（tobacco） tobacco（タバコ） モザイクウイルスエンハンサー enhancer エンハンサー（enhancer） enhancer（エンハンサー） 配列（キャップの代替）、長い3’UTR（ポリAの代替）、あらかじめイントロンを除いたcDNA（スプライシングの代替）といった人工的な代替物が用いられる。
• in vitro翻訳（無細胞タンパク質合成cell-free protein synthesis無細胞タンパク質合成（cell-free protein synthesis）cell-free protein synthesis（無細胞タンパク質合成））はコムギ胚芽抽出液 wheat germ extract コムギ胚芽抽出液（wheat germ extract） wheat germ extract（コムギ胚芽抽出液） （リボソーム、tRNA、翻訳因子、アミノ酸、エネルギー源を含む）とin vitro合成されたmRNAを用いて、生きた細胞なしにGFPなどの目的タンパク質を試験管内 in vitro 試験管内（in vitro） in vitro（試験管内） で産生する。無細胞系にはこのほかウサギ網赤血球ライセート rabbit reticulocyte lysate ウサギ網赤血球ライセート（rabbit reticulocyte lysate） rabbit reticulocyte lysate（ウサギ網赤血球ライセート） と大腸菌抽出液がある。
• 「二層epiblast/hypoblast 二層（epiblast/hypoblast）epiblast/hypoblast（二層） （バイレイヤー）法」は翻訳混合液と基質混合液を重ねて基質供給と副産物除去を続ける反応形式で、バッチ法の10倍超の収量を与える——RNAポリメラーゼを抜いた陰性対照の試験管とは別の話である。