タンパク質の診断・構造解析法とその医学的応用；LDHサブユニットのゲル電気泳動

🧠 タンパク質分析protein analysis タンパク質分析（protein analysis）protein analysis（タンパク質分析） は「大きさで分ける（SDS-PAGESDS-PAGE, sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis）」「特異的に検出する（ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）・活性染色）」の2軸で読む。 混合物から目的タンパク質を同定・特徴づける。物理的性質physical nature 物理的性質（physical nature）physical nature（物理的性質） （分子量）か機能的性質（酵素活性）を手がかりにする。実習ではLDHLDH（lactate dehydrogenase）アイソザイム isoenzyme アイソザイム（isoenzyme） isoenzyme（アイソザイム） を電気泳動で分け、組織ごとのパターンを見る。

タンパク質分析の考え方

タンパク質分析protein analysis タンパク質分析（protein analysis）protein analysis（タンパク質分析） は、診断と特徴づけに分かれる。

• 診断: タンパク質混合物や生体試料（血液など）から目的タンパク質を同定。物理的性質physical nature 物理的性質（physical nature）physical nature（物理的性質） （分子量）または機能的性質（酵素活性）に基づく。
• 特徴づけ: 目的タンパク質を単離・精製purification 精製（purification）purification（精製） し、夾雑物のない標品を得る。

SDS-PAGE（電気泳動による分離）

SDSSDS（sodium dodecyl sulfate）-ポリアクリルアミドゲル電気泳動 SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE） SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動） は、タンパク質を主として大きさ（見かけの分子量）で分ける一般的な方法である。¹

自由溶液中では移動速度は「大きさ・形」と「正味電荷」の両方に依存する。SDS-PAGEはこれを大きさだけに単純化する。

💡 SDSが「電荷/質量比」を一定にする。 SDSはタンパク質1 gあたり約1.4 gも結合し、元の電荷を無視 neglect 無視（neglect） neglect（無視） できるほどの負電荷で覆う。全タンパク質が同じ電荷/質量比・同じ向き（陽極positive electrode 陽極（positive electrode）positive electrode（陽極） へ）で動くため、あとはゲルの分子ふるい molecular sieving 分子ふるい（molecular sieving） molecular sieving（分子ふるい） 効果だけが速度を決める。相対移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） は分子量の対数に対してほぼ直線的に減少する（大きいほど遅い）。そのため、分子量既知のマーカーで「log（分子量）対 移動距離excursion (distance of movement)移動距離（excursion (distance of movement)）excursion (distance of movement)（移動距離）」の検量線 calibration curve 検量線（calibration curve） calibration curve（検量線） を引けば、未知のタンパク質の見かけの分子量を読み取れる。

flowchart TD
  A["タンパク質混合物"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sodium dodecyl sulfate'>SDS</span>＋還元剤＋加熱<br>変性・直鎖化・均一な負電荷"]
  B --> C["ポリアクリルアミドゲルへ添加"]
  C --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='electric field'>電場</span>で<span class='jp-term jp-term-diagram' title='positive electrode'>陽極</span>へ移動<br>大きいほど遅い（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='molecular sieving'>分子ふるい</span>）"]
  D --> E["分子量で分離されたバンド"]

ウェスタンブロット法（特異的検出）

SDS-PAGEで分けたタンパク質を膜に転写し、抗体で特定のタンパク質を検出するのがウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）。分子量による分離＋抗体による特異性で、目的タンパク質を確認できる。

LDHアイソザイムの電気泳動

乳酸脱水素酵素lactate dehydrogenase, LDH乳酸脱水素酵素（lactate dehydrogenase, LDH）lactate dehydrogenase, LDH（乳酸脱水素酵素）は、H型（心筋型）とM型（骨格筋型skeletal muscle isoform骨格筋型（skeletal muscle isoform）skeletal muscle isoform（骨格筋型））の2種のサブユニットが4つ集まった四量体 tetramer四量体（tetramer） tetramer（四量体）。組み合わせで5種のアイソザイム isoenzyme アイソザイム（isoenzyme） isoenzyme（アイソザイム） ができる。

アイソザイムisoenzyme アイソザイム（isoenzyme）isoenzyme（アイソザイム） の分離は、SDSも還元剤も使わない非変性（ネイティブ）ゲル電気泳動 gel electrophoresisゲル電気泳動（gel electrophoresis） gel electrophoresis（ゲル電気泳動）で行う。SDS-PAGEでは四量体 tetramer 四量体（tetramer） tetramer（四量体） がサブユニットにばらけ、酵素活性も失われるからである。非変性条件では四量体 tetramer 四量体（tetramer） tetramer（四量体） のまま正味電荷の差で分かれ、H サブユニットが多いほど負電荷が大きく陽極 positive electrode 陽極（positive electrode） positive electrode（陽極） 側へ速く進む（LDH-1 が最も陽極 positive electrode 陽極（positive electrode） positive electrode（陽極） 寄り、LDH-5 が最も陰極 negative electrode 陰極（negative electrode） negative electrode（陰極） 寄り）。

⭐ アイソザイムisoenzyme アイソザイム（isoenzyme）isoenzyme（アイソザイム） のパターンは障害臓器推定の手がかりになりうる。 同じ反応を触媒しても組織ごとに構成が異なるため、血中LDHアイソザイム isoenzyme アイソザイム（isoenzyme） isoenzyme（アイソザイム） パターンは参考になる。ただし急性心筋梗塞の診断では、心筋トロポニンcardiac troponin 心筋トロポニン（cardiac troponin）cardiac troponin（心筋トロポニン） が現在の「ゴールドスタンダードgold standardゴールドスタンダード（gold standard）gold standard（ゴールドスタンダード）」で、ほかの壊死マーカーでトロポニン troponin トロポニン（troponin） troponin（トロポニン） に優るものは示されていない。² 心筋梗塞の普遍的定義（第4版、2018年）は、心筋傷害myocardial injury 心筋傷害（myocardial injury）myocardial injury（心筋傷害） の評価に心筋トロポニンcardiac troponin心筋トロポニン（cardiac troponin）cardiac troponin（心筋トロポニン）（I または T）を優先するバイオマーカー Biomarkers バイオマーカー（Biomarkers） Biomarkers（バイオマーカー） とし、日常診療には高感度測定法を推奨し、CK-MBなどほかのマーカーは感度・特異度とも劣るとしている。³ かつて心筋梗塞の診断に使われたLDHアイソザイム isoenzyme アイソザイム（isoenzyme） isoenzyme（アイソザイム） （LDH-1 が LDH-2 を上回る「フリップ」）は、現在は歴史的・補助的な意義にとどまる。

活性染色による検出

実習ではLDHの酵素活性を利用して染色する。ゲルを、基質の乳酸・補酵素coenzyme 補酵素（coenzyme）coenzyme（補酵素） のNAD⁺・2つの電子受容体を含む発色液に浸すと、LDH活性のある位置だけ発色する。LDHが作ったNADHの電子が、一次電子受容体のフェナジンメトサルフェート phenazine methosulphate フェナジンメトサルフェート（phenazine methosulphate） phenazine methosulphate（フェナジンメトサルフェート） を経て最終電子受容体のテトラゾリウムブルー tetrazolium blue テトラゾリウムブルー（tetrazolium blue） tetrazolium blue（テトラゾリウムブルー） へ渡り、不溶性で有色のホルマザン formazan ホルマザン（formazan） formazan（ホルマザン） がその場に沈着する。

flowchart TD
  LAC["乳酸"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='lactate dehydrogenase, LDH'>乳酸脱水素酵素</span>（ゲル中のバンド）<br>乳酸の水素を NAD⁺ へ移す（可逆反応）"| PYR["ピルビン酸"]
  NAD["NAD⁺"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='lactate dehydrogenase, LDH'>乳酸脱水素酵素</span>（ゲル中のバンド）<br>乳酸の水素を NAD⁺ へ移す（可逆反応）"| NADH["NADH ＋ H⁺"]
  PMS["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='phenazine methosulphate'>フェナジンメトサルフェート</span><br>酸化型"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>な電子移動<br>NADH ＋ H⁺ → NAD⁺"| PMSH["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='reduced form'>還元型</span><span class='jp-term jp-term-diagram' title='phenazine methosulphate'>フェナジンメトサルフェート</span>"]
  TB["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='tetrazolium blue'>テトラゾリウムブルー</span><br>淡色・可溶性"] -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>な電子移動<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='reduced form'>還元型</span><span class='jp-term jp-term-diagram' title='phenazine methosulphate'>フェナジンメトサルフェート</span> → 酸化型"| FOR["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='formazan'>ホルマザン</span><br>有色・不溶性でバンドの位置に沈着"]
  PMSH -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='non-enzymatic'>非酵素的</span>な電子移動<br><span class='jp-term jp-term-diagram' title='tetrazolium blue'>テトラゾリウムブルー</span>へ電子を渡して酸化型に戻り再利用"| PMS

💡 なぜ電子の「中継役」が要るのか。 NADHはテトラゾリウム塩を直接還元するのが遅いので、フェナジンメトサルフェートphenazine methosulphate フェナジンメトサルフェート（phenazine methosulphate）phenazine methosulphate（フェナジンメトサルフェート） が電子をすばやく受け取ってテトラゾリウムへ渡す。発色量はLDHが作ったNADHの量、つまりその位置の酵素活性に比例する。生体内in vivo 生体内（in vivo）in vivo（生体内） でのLDHは主に逆向き（ピルビン酸 ＋ NADH → 乳酸 ＋ NAD⁺）に働くが、反応は可逆なので、乳酸とNAD⁺を過剰に与えれば染色の向きに進む。

まとめ

• タンパク質分析protein analysis タンパク質分析（protein analysis）protein analysis（タンパク質分析） は「大きさで分ける（SDS-PAGE）」と「特異的に検出（ウェスタンブロットWestern blotウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット）・活性染色）」。
• SDS-PAGEはSDSで変性・均一な負電荷を付与し、分子ふるいmolecular sieving 分子ふるい（molecular sieving）molecular sieving（分子ふるい） で大きさだけで分離。相対移動度 mobility 移動度（mobility） mobility（移動度） は分子量の対数に対してほぼ直線的に減少し、マーカーの検量線 calibration curve 検量線（calibration curve） calibration curve（検量線） で分子量を推定する。
• 還元剤（β-メルカプトエタノール・ジチオトレイトールdithiothreitol (DTT)ジチオトレイトール（dithiothreitol (DTT)）dithiothreitol (DTT)（ジチオトレイトール））でS−S結合を切断する。
• LDHはH型・M型サブユニットの四量体 tetramer 四量体（tetramer） tetramer（四量体） で5アイソザイム isoenzymeアイソザイム（isoenzyme） isoenzyme（アイソザイム）。非変性電気泳動で電荷の差により分け、LDH-1 が最も陽極 positive electrode 陽極（positive electrode） positive electrode（陽極） 寄り。組織分布tissue distribution 組織分布（tissue distribution）tissue distribution（組織分布） は障害臓器推定の参考になるが、心筋梗塞診断では心筋トロポニン cardiac troponin 心筋トロポニン（cardiac troponin） cardiac troponin（心筋トロポニン） が優先され、LDHアイソザイム isoenzyme アイソザイム（isoenzyme） isoenzyme（アイソザイム） は歴史的・補助的。
• 実習では乳酸・NAD⁺を与え、NADH → フェナジンメトサルフェートphenazine methosulphateフェナジンメトサルフェート（phenazine methosulphate）phenazine methosulphate（フェナジンメトサルフェート） → テトラゾリウムブルーtetrazolium blue テトラゾリウムブルー（tetrazolium blue）tetrazolium blue（テトラゾリウムブルー） （→ ホルマザンformazanホルマザン（formazan）formazan（ホルマザン））と電子を渡す活性染色でLDHを検出する。