配偶子形成

🧠 このセミナーは「不妊症infertility不妊症（infertility）infertility（不妊症）の原因を突き止める」という臨床課題を軸に、配偶子形成gametogenesis配偶子形成（gametogenesis）gametogenesis（配偶子形成）の細胞生物学（不分離non-disjunction不分離（non-disjunction）non-disjunction（不分離）のリスク）→生殖補助医療assisted reproductive technology (ART)生殖補助医療（assisted reproductive technology (ART)）assisted reproductive technology (ART)（生殖補助医療）→着床前遺伝学的検査preimplantation genetic testing (PGT)着床前遺伝学的検査（preimplantation genetic testing (PGT)）preimplantation genetic testing (PGT)（着床前遺伝学的検査）という3段階のロジックで読む。 2つの実症例（D-二機能性タンパク欠損症DBP deficiency二機能性タンパク欠損症（DBP deficiency）DBP deficiency（二機能性タンパク欠損症）、球状spherical球状（spherical）spherical（球状）精子症）はいずれも「不妊の原因を全ゲノム規模の検査で遡って突き止める」という同じ探偵仕事のパターンを示す。

配偶子形成のリスク

生殖細胞が接合体になるという配偶子形成gametogenesis配偶子形成（gametogenesis）gametogenesis（配偶子形成）の本質的リスクは、減数分裂性不分離meiotic non-disjunction減数分裂性不分離（meiotic non-disjunction）meiotic non-disjunction（減数分裂性不分離）——異数性ゲノム変異aneuploid genome mutation異数性ゲノム変異（aneuploid genome mutation）aneuploid genome mutation（異数性ゲノム変異）の原因（02-1-genetic-aspects-of-atypical-mitosis-and-meiosisも参照）。

⭐ 不分離non-disjunction不分離（non-disjunction）non-disjunction（不分離）の起こりやすさは「染色体の種類」と「どちらの配偶子形成gametogenesis配偶子形成（gametogenesis）gametogenesis（配偶子形成）か」で系統的に異なる。 常染色体トリソミーの大半は母性maternal母性（maternal）maternal（母性）減数分裂Iのエラーに由来する（02-2-chromosomal-aberrationsの親由来parent-of-origin親由来（parent-of-origin）parent-of-origin（親由来）別頻度表も参照）。一方、性染色体gonosome性染色体（gonosome）gonosome（性染色体）の不分離non-disjunction不分離（non-disjunction）non-disjunction（不分離）は精子形成でより高頻度——常染色体と性染色体gonosome性染色体（gonosome）gonosome（性染色体）で「どちらの親でリスクが高いか」が逆転する点に注意。

受精のプロセス

減数分裂IIの完了→雄性染色体gonosome性染色体（gonosome）gonosome（性染色体）の脱凝縮→雌雄前核pronuclei雌雄前核（pronuclei）pronuclei（雌雄前核）の形成→前核の融合pronuclear fusion前核の融合（pronuclear fusion）pronuclear fusion（前核の融合）→接合体——受精卵fertilized egg受精卵（fertilized egg）fertilized egg（受精卵）は2つの極体polar body極体（polar body）polar body（極体）と2つの前核two pronuclei2つの前核（two pronuclei）two pronuclei（2つの前核）をもつ状態で観察される（Day 1、直径約0.1mm）。卵管を通じて輸送される。

症例1：不妊と診断オデッセイ——D-二機能性タンパク欠損症

35歳男性、小児期から進行する認知機能cognitive function認知機能（cognitive function）cognitive function（認知機能）障害・感音難聴・歩行障害gait disturbance歩行障害（gait disturbance）gait disturbance（歩行障害）・不妊。近親婚consanguineous marriage近親婚（consanguineous marriage）consanguineous marriage（近親婚）のない神経学的neurological神経学的（neurological）neurological（神経学的）に健常な両親の息子で、健常・妊孕性のある姉妹が1人。

不妊の疫学： 12か月後に妊娠しないカップルの割合を不妊と定義——1年以内の妊娠成功率85〜90%、カップルの約15%が不妊。

精査： 精液検査semen analysis精液検査（semen analysis）semen analysis（精液検査）（spermiogram：肉眼的検査・顕微鏡検査microscopy顕微鏡検査（microscopy）microscopy（顕微鏡検査）＋白血球・細菌の有無）で無精子症azoospermia無精子症（azoospermia）azoospermia（無精子症）を確認。非閉塞性無精子症azoospermia無精子症（azoospermia）azoospermia（無精子症）の稀な遺伝的原因genetic origin遺伝的原因（genetic origin）genetic origin（遺伝的原因）は累積cumulative累積（cumulative）cumulative（累積）でも全体の5%未満——カルマン症候群Kallmann syndromeカルマン症候群（Kallmann syndrome）Kallmann syndrome（カルマン症候群）（既知変異は少数）、クラインフェルター症候群Klinefelter syndromeクラインフェルター症候群（Klinefelter syndrome）Klinefelter syndrome（クラインフェルター症候群）、転座を伴う男性（偽半陰陽hermaphroditism半陰陽（hermaphroditism）hermaphroditism（半陰陽）、SRY転座、04-2-role-of-sex-in-inheritance参照）、点変異/CNV（USP26・SOX3・TEX11・TEX14・MEIOB・DNAH6・DAZL・DAX-1・DMRT1等）。

内分泌検査： テストステロン低値（164 ng/dL、基準270〜1100）、FSH高値（15 mIU/mL、基準1〜8）、LH・ソマトメジンSomatomedinsソマトメジン（Somatomedins）Somatomedins（ソマトメジン）・プロラクチンは正常範囲。血中アミノ酸プロファイル異常（アラニンalanineアラニン（alanine）alanine（アラニン）・アスパラギンasparagineアスパラギン（asparagine）asparagine（アスパラギン）・グルタミン酸・イソロイシンisoleucine (Ile)イソロイシン（isoleucine (Ile)）isoleucine (Ile)（イソロイシン）・リジン・メチオニンmethionineメチオニン（methionine）methionine（メチオニン）・プロリンprolineプロリン（proline）proline（プロリン）・バリンvalineバリン（valine）valine（バリン）が軒並み基準値baseline / reference value基準値（baseline / reference value）baseline / reference value（基準値）超）。

遺伝子検査genetic testing遺伝子検査（genetic testing）genetic testing（遺伝子検査）の経過： ①ミトコンドリア・運動失調ataxia運動失調（ataxia）ataxia（運動失調）症関連18遺伝子のパネル検査（SCA1〜17・DRPLA・FRDA・AOA1/2・POLG・MELAS・MERRF・NARP）は陰性、②筋生検muscle biopsy筋生検（muscle biopsy）muscle biopsy（筋生検）の電子伝達系electron transport chain電子伝達系（electron transport chain）electron transport chain（電子伝達系）検査は正常、③標的エクソームexomeエクソーム（exome）exome（エクソーム）シーケンシング（mtDNA＋核遺伝子1,598個のエクソン）で1,569個のSNV・InDelを検出——HSD17B4遺伝子（17β-ヒドロキシステロイド脱水素酵素IV、ペルオキシソームperoxisomeペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム）脂肪酸β酸化fatty acid beta-oxidation脂肪酸β酸化（fatty acid beta-oxidation）fatty acid beta-oxidation（脂肪酸β酸化）に関与）のエクソン11-13の13kb欠失＋ミスセンスmissense (mutation)ミスセンス（missense (mutation)）missense (mutation)（ミスセンス）SNV（c.587C>T; p.A196V）を同定。

⭐ プロバンドprobandプロバンド（proband）proband（プロバンド）は複合ヘテロ接合体compound heterozygote複合ヘテロ接合体（compound heterozygote）compound heterozygote（複合ヘテロ接合体）——2つの異なる変異（欠失＋ミスセンスmissense (mutation)ミスセンス（missense (mutation)）missense (mutation)（ミスセンス））の組み合わせがこの疾患の正体だった。 サンガー法Sanger sequencingサンガー法（Sanger sequencing）Sanger sequencing（サンガー法）でミスセンス変異missense mutationミスセンス変異（missense mutation）missense mutation（ミスセンス変異）を、対立opposition対立（opposition）opposition（対立）遺伝子特異的PCR（野生型386bp vs 欠失特異的785bp）で欠失を確認——診断：D-二機能性タンパク欠損症DBP deficiency二機能性タンパク欠損症（DBP deficiency）DBP deficiency（二機能性タンパク欠損症）、通常生後2年以内に致死的なペルオキシソームperoxisomeペルオキシソーム（peroxisome）peroxisome（ペルオキシソーム）脂肪酸β酸化fatty acid beta-oxidation脂肪酸β酸化（fatty acid beta-oxidation）fatty acid beta-oxidation（脂肪酸β酸化）の重篤な障害。HSD17B4の劣性変異はペロー症候群Perrault syndromeペロー症候群（Perrault syndrome）Perrault syndrome（ペロー症候群）（Perrault syndrome：卵巣形成異常＋感音難聴、末梢神経障害・運動失調ataxia運動失調（ataxia）ataxia（運動失調）を伴うことがある）の原因としても最近同定されている——1つの遺伝子が複数の臨床像（対立遺伝子異質性allelic heterogeneity対立遺伝子異質性（allelic heterogeneity）allelic heterogeneity（対立遺伝子異質性）・表現度expressivity表現度（expressivity）expressivity（表現度）の変動）を生む例（04-1-monogenic-inheritance参照）。

生殖補助医療

不妊治療に用いられる医療技術——3つの軸で分類される：①配偶子の由来（夫婦 or ドナー）、②受精の場（妻の体内、検査室、代理母）、③妊娠の担い手（妻、代理母）。

主な技術： 配偶子卵管内移植gamete intrafallopian transfer (GIFT)配偶子卵管内移植（gamete intrafallopian transfer (GIFT)）gamete intrafallopian transfer (GIFT)（配偶子卵管内移植）、体外受精in vitro fertilization (IVF)体外受精（in vitro fertilization (IVF)）in vitro fertilization (IVF)（体外受精）・胚移植IVF+ET胚移植（IVF+ET）IVF+ET（胚移植）、顕微授精intracytoplasmic sperm injection, ICSI顕微授精（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）intracytoplasmic sperm injection, ICSI（顕微授精）。

適応： 男性不妊male infertility男性不妊（male infertility）male infertility（男性不妊）（精子異常：無精子症azoospermia無精子症（azoospermia）azoospermia（無精子症）・球状spherical球状（spherical）spherical（球状）精子症・精子DNA断片化sperm DNA fragmentation精子DNA断片化（sperm DNA fragmentation）sperm DNA fragmentation（精子DNA断片化））、着床前遺伝学的検査preimplantation genetic testing (PGT)着床前遺伝学的検査（preimplantation genetic testing (PGT)）preimplantation genetic testing (PGT)（着床前遺伝学的検査）を要する場合、女性不妊＋健常精子（卵管結紮ligation結紮（ligation）ligation（結紮）等：通常のIVF）。円形精子細胞round spermatid円形精子細胞（round spermatid）round spermatid（円形精子細胞）も受精に利用可能な場合がある。

胚培養の基本要件： 培養液（20種のアミノ酸を含む）、低酸素濃度、低/無VOC環境、最長培養5日間——EmbryoScope（内蔵カメラcameraカメラ（camera）camera（カメラ）・顕微鏡による胚発生embryogenesis胚発生（embryogenesis）embryogenesis（胚発生）モニタリング）は形態・形態動態morphokinetics形態動態（morphokinetics）morphokinetics（形態動態）に基づく胚選択を支援する。胚は接合体から胚盤胞blastocyst胚盤胞（blastocyst）blastocyst（胚盤胞）（blastocyst、Day 5）まで発生し、通常Day3またはDay5で移植される。

着床前遺伝学的検査

胚が抱える遺伝的リスクには孤発性sporadic孤発性（sporadic）sporadic（孤発性）（sporadic：無作為、加齢関連）と再発性（単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）の遺伝による）の2種がある。

PGT（2017年に導入された総称）＝卵子ovum卵子（ovum）ovum（卵子）・胚の遺伝的異常genetic abnormality遺伝的異常（genetic abnormality）genetic abnormality（遺伝的異常）、またはHLA型を判定するすべてのDNA検査。

生検組織の種類と比較

PGTの臨床適応clinical uses臨床適応（clinical uses）clinical uses（臨床適応）： 単一遺伝子疾患monogenic disease単一遺伝子疾患（monogenic disease）monogenic disease（単一遺伝子疾患）の家族歴、片親の均衡型転座balanced translocation均衡型転座（balanced translocation）balanced translocation（均衡型転座）、高齢妊娠advanced maternal age高齢妊娠（advanced maternal age）advanced maternal age（高齢妊娠）（異数性aneuploidy異数性（aneuploidy）aneuploidy（異数性）リスク）、反復IVF不成功、習慣流産、同胞のHLAマッチングを目的とした胚選択。

PGT/PGS で用いられる分子遺伝学的手法

核型検査karyotyping核型検査（karyotyping）karyotyping（核型検査）（G分染、ゴールドスタンダードgold standardゴールドスタンダード（gold standard）gold standard（ゴールドスタンダード））、QF-PCR、FISH、MLPAmultiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)MLPA（multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)）multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA)（MLPA）（04-8-sex-linked-inheritance参照）、aCGH（array comparative genomic hybridization）、NGS。

💡 aCGH（比較ゲノムハイブリダイゼーションhybridizationハイブリダイゼーション（hybridization）hybridization（ハイブリダイゼーション））は「2色の蛍光シグナルの相対強度」でコピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）を読む手法。 被検試料と対照試料をそれぞれ異なる蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素）で標識し、健常人の中期染色体metaphase chromosome中期染色体（metaphase chromosome）metaphase chromosome（中期染色体）スプレッド（またはアレイ）に競合的competitive競合的（competitive）competitive（競合的）にハイブリダイズさせる——シグナル比率が均等（＝1）なら正常、相対比>1.2で余剰コピー（重複）、<0.85で欠損と判定する。分解能は約100kb——G分染法G-bandingG分染法（G-banding）G-banding（G分染法）（5〜10Mb）よりはるかに高分解能high resolution, HR高分解能（high resolution, HR）high resolution, HR（高分解能）だが、FISHと異なりあらかじめ選んだ領域に限定されない全ゲノム的な検査が可能。欠点：腫瘍検体では健常細胞の混入（コンタミネーションcontaminationコンタミネーション（contamination）contamination（コンタミネーション））が結果に影響しうる。臨床応用clinical applications臨床応用（clinical applications）clinical applications（臨床応用）： 疾患特化型アレイ（DMDアレイ等）、血液腫瘍・がんアレイ、出生前アレイ、着床前アレイ。

症例： ある症例では胎児で第11染色体q22.3-q23.3領域に8.97Mbの欠失がaCGHで検出された。

症例3：家族性球状精子症とSPATA16遺伝子

生殖医療センターを受診した家系——6人の兄弟（罹患3人・健常3人）と4人の姉妹。健常な3人の兄弟はそれぞれ7人・6人・5人の子をもうけたが、罹患した3人の兄弟は子をもたず、乏精子症oligozoospermia乏精子症（oligozoospermia）oligozoospermia（乏精子症）・精子無力症asthenozoospermia精子無力症（asthenozoospermia）asthenozoospermia（精子無力症）・奇形精子症teratozoospermia奇形精子症（teratozoospermia）teratozoospermia（奇形精子症）を伴う完全球状spherical球状（spherical）spherical（球状）精子症（円頭・先体acrosome先体（acrosome）acrosome（先体）欠損：roundheadedness and acrosomelessness）を呈した。

ICSIを実施したが受精率は不良で妊娠に至らなかった。 Y染色体微小欠失microdeletion微小欠失（microdeletion）microdeletion（微小欠失）（04-8-sex-linked-inheritanceのAZF領域も参照）は検出されず、核型は46,XYと正常。

⭐ 10Kの全ゲノムSNPアレイが「近親婚consanguineous marriage近親婚（consanguineous marriage）consanguineous marriage（近親婚）」という隠れた背景を暴いた。 6人の兄弟全員に広範なホモ接合領域が観察され、家系内の2〜3親等の近親婚consanguineous marriage近親婚（consanguineous marriage）consanguineous marriage（近親婚）が示唆された——SPATA16遺伝子（精子形成関連16）エクソン4のSNP（c.848G>A）が原因変異として同定され、制限酵素restriction endonuclease制限酵素（restriction endonuclease）restriction endonuclease（制限酵素）認識部位（NciI／HpaII）を破壊するミスセンス変異missense mutationミスセンス変異（missense mutation）missense mutation（ミスセンス変異）であることが確認された。近親婚consanguineous marriage近親婚（consanguineous marriage）consanguineous marriage（近親婚）がホモ接合劣性疾患の発見に果たす役割を、実際の家系解析で示す好例（04-6-autosomal-recessive-inheritance-ar-iの相補性complementation相補性（complementation）complementation（相補性）の議論、06-1-population-geneticsの家族内ゲノム類似性の項も参照）。

まとめ

• 配偶子形成gametogenesis配偶子形成（gametogenesis）gametogenesis（配偶子形成）の本質的リスクは減数分裂性不分離meiotic non-disjunction減数分裂性不分離（meiotic non-disjunction）meiotic non-disjunction（減数分裂性不分離）で、常染色体トリソミーは母性maternal母性（maternal）maternal（母性）減数分裂Iに、性染色体gonosome性染色体（gonosome）gonosome（性染色体）不分離non-disjunction不分離（non-disjunction）non-disjunction（不分離）は精子形成により多く由来する。受精は減数分裂II完了→前核形成pronucleus formation前核形成（pronucleus formation）pronucleus formation（前核形成）→融合という経過をたどる。
• 症例1（DBP欠損症/ペロー症候群Perrault syndromeペロー症候群（Perrault syndrome）Perrault syndrome（ペロー症候群））は、無精子症azoospermia無精子症（azoospermia）azoospermia（無精子症）・内分泌異常・血中アミノ酸異常から出発し、標的エクソームexomeエクソーム（exome）exome（エクソーム）シーケンシングでHSD17B4遺伝子の複合ヘテロ接合compound heterozygous複合ヘテロ接合（compound heterozygous）compound heterozygous（複合ヘテロ接合）変異（欠失＋ミスセンスmissense (mutation)ミスセンス（missense (mutation)）missense (mutation)（ミスセンス））にたどり着く診断オデッセイを示す。
• ARTは相同的/異型的の別、GIFT/IVF/ICSIという技術、EmbryoScopeによる胚モニタリングを含み、PGT（A/M/SR/HLA）は極体polar body極体（polar body）polar body（極体）・割球blastomere割球（blastomere）blastomere（割球）・栄養外胚葉trophectoderm栄養外胚葉（trophectoderm）trophectoderm（栄養外胚葉）という3種の生検組織（それぞれ異なる利点・欠点）を対象に、核型検査karyotyping核型検査（karyotyping）karyotyping（核型検査）からaCGH・NGSまでの手法で実施される。
• aCGHは2色蛍光シグナル比によりコピー数copy numberコピー数（copy number）copy number（コピー数）変化を約100kb分解能で検出する。症例3（家族性球状spherical球状（spherical）spherical（球状）精子症）はSNPアレイによるホモ接合性homozygousホモ接合性（homozygous）homozygous（ホモ接合性）マッピングが近親婚consanguineous marriage近親婚（consanguineous marriage）consanguineous marriage（近親婚）の同定とSPATA16遺伝子変異の発見に直結した実例。