フローサイトメトリー（手法 III）

🧠 フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） は「1細胞ずつ・多パラメータ Parameter パラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ） で・高速に」を同時に実現する検査法として読む。 1回の測定で10⁵〜10⁶個もの細胞を解析でき、微小残存病変measurable residual disease, MRD 微小残存病変（measurable residual disease, MRD）measurable residual disease, MRD（微小残存病変） のような稀な細胞集団も検出できる代わりに、高価で専門性の高い装置・人材を要する。原理は単純——毛細管内を一列に並んだ細胞がレーザー光を横切り、散乱光scattered light 散乱光（scattered light）scattered light（散乱光） （サイズ・顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度））と蛍光（抗体標識）を同時に検出する。

利点と欠点

原理：光散乱と蛍光の同時検出

毛細管内でレーザービームの前を細胞が一列に並んで通過する。前方散乱光forward scatter, FSC前方散乱光（forward scatter, FSC）forward scatter, FSC（前方散乱光）は相対的な細胞サイズを、側方散乱光side scatter, SSC側方散乱光（side scatter, SSC）side scatter, SSC（側方散乱光）は顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度）を反映する。

⭐ FSC/SSCの散乱図だけで、リンパ球・単球・顆粒球を大まかに区別できる。 サイズと顆粒度 granularity 顆粒度（granularity） granularity（顆粒度） という2つの物理的パラメータ Parameter パラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ） だけで、リンパ球（小型・低顆粒hypogranulation 低顆粒（hypogranulation）hypogranulation（低顆粒） 度）・単球（中型）・好中球/好酸球/好塩基球basophil 好塩基球（basophil）basophil（好塩基球） （大型・高顆粒度 granularity顆粒度（granularity） granularity（顆粒度））という白血球サブセットが散布図上で異なる領域に分離する——抗体標識なしでも得られる、最初のふるい分け。

ゲーティング

ゲーティングgating ゲーティング（gating）gating（ゲーティング） ＝細胞集団の定義。代表的なゲーティング gating ゲーティング（gating） gating（ゲーティング） マーカー：CD45（白血球共通抗原、leukocyte common antigen、タンパクチロシンホスファターゼ）ですべての白血球を選別し、CD14（細菌リポ多糖 lipopolysaccharide (LPS) リポ多糖（lipopolysaccharide (LPS)） lipopolysaccharide (LPS)（リポ多糖） の共受容体 co-receptor共受容体（co-receptor） co-receptor（共受容体）、主にマクロファージ・単球に発現）でさらに単球系 monocytic 単球系（monocytic） monocytic（単球系） を絞り込む。

免疫表現型検査が答える3つの問い

💡 ヒストグラムの「山の位置」と「山の高さ」は違う情報を示す。 2つの検体を比較する古典的な教育例：山が左にシフトすれば「1細胞あたりの抗原発現量が少ない」ことを、山の高さ（陽性細胞の割合）が変われば「抗原を発現する細胞の比率が違う」ことを意味する——同じ「差」でも解釈すべき軸が異なる。自家蛍光autofluorescence 自家蛍光（autofluorescence）autofluorescence（自家蛍光） や非特異的結合 aspecific binding 非特異的結合（aspecific binding） aspecific binding（非特異的結合） もこの判定を妨げる要因になる。

⚠️ CD4は健常者でもリンパ球だけに発現するわけではない。 リンパ球ではCD4が高発現（CD4^high+）だが、単球でも低発現（CD4^dim+）している——同じマーカーでも細胞種により発現「量」が異なり、これを見分けるにも定量的な蛍光強度の評価が必要になる。2色の蛍光色素 fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素） を同時に使うことで、共発現co-expression 共発現（co-expression）co-expression（共発現） 解析（例：CD3×CD4のドットプロット）が可能になる。

💡 色を増やすほど「重なり」の処理そのものが本題になる——スピルオーバー spillover スピルオーバー（spillover） spillover（スピルオーバー） と補正。 蛍光色素fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素） の発光スペクトル emission spectrum 発光スペクトル（emission spectrum） emission spectrum（発光スペクトル） は互いに重なるため、ある検出器には目的の色素以外の光も漏れ込む（スピルオーバーspilloverスピルオーバー（spillover）spillover（スピルオーバー））。これを差し引くのが補正compensation補正（compensation）compensation（補正）だが、補正は誤差まで一緒に引き伸ばす——光子計数 counting 計数（counting） counting（計数） の統計に由来する非線形non-linear非線形（non-linear）non-linear（非線形）の誤差、測定誤差measurement error測定誤差（measurement error）measurement error（測定誤差）、対数軸のビニング誤差が補正後のデータに乗り、軸上に張り付いた事象の集積や、補正しても自家蛍光 autofluorescence 自家蛍光（autofluorescence） autofluorescence（自家蛍光） レベルまで下がりきらない分布として現れる¹。「補正さえすれば色は何色でも足せる」わけではない、というのが色数の実際的な上限を決めている。

💡 その上限は2方向に押し広げられた——スペクトラルフローとマスサイトメトリー。 ①スペクトラルフローサイトメトリー flow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry） flow cytometry（フローサイトメトリー）は検出器ごとに色を割り当てるのではなく全スペクトルを取得してアンミキシングするため、従来は同時に使えなかった色素の組み合わせが使えるようになり、41マーカー・37色規模のパネルが報告されている²。②マスサイトメトリー（CyTOF）は蛍光色素 fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素） ではなく安定同位体 isotope 同位体（isotope） isotope（同位体） の金属で抗体を標識し飛行時間型質量分析 mass spectrometry 質量分析（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析） で読むため、原理的にスピルオーバー spillover スピルオーバー（spillover） spillover（スピルオーバー） が小さく、2011年の時点で1細胞あたり34パラメータ Parameterパラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ）（31抗体＋生死＋DNADNA（deoxyribonucleic acid）量＋細胞サイズ）の同時測定が示されている³。ただしCyTOFは蛍光を使わないため、下記の蛍光に基づくソーティング cell sorting ソーティング（cell sorting） cell sorting（ソーティング） （FACS）とは組み合わせられない——多パラメータ Parameter パラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ） 化と細胞回収は、いまのところ別々の道具 tool 道具（tool） tool（道具） である。

リンパ球サブセットパネル

CD3・CD4・CD8・CD19・CD56などの組み合わせでT・B・NK・Tc・Th・Treg・形質細胞などのサブセットを識別する（01-2-the-immune-system-in-the-labのCD marker表も参照）。細胞内サイトカイン（IFN-γ・IL-4IL-4（interleukin-4）・IL-17等）の同時検出により、機能的な特徴づけ（Th1/Th2/Th17の判別など）も可能——ただし細胞内分子 intracellular molecule 細胞内分子（intracellular molecule） intracellular molecule（細胞内分子） の検出には透過処理 permeabilization 透過処理（permeabilization） permeabilization（透過処理） を要する。

ソーティング

帯電させた液滴を静電場 electric field 電場（electric field） electric field（電場） で偏向させることで、蛍光シグナルに基づいて生きた細胞を物理的に分離・回収できる（FACS：fluorescence-activated cell sorting）。

臨床応用

症例：多発性骨髄腫の免疫表現型解析

造血器悪性腫瘍hematological malignancy 造血器悪性腫瘍（hematological malignancy）hematological malignancy（造血器悪性腫瘍） の診断は、症状・形態学的検査（血算、骨髄塗抹bone marrow smear骨髄塗抹（bone marrow smear）bone marrow smear（骨髄塗抹）・生検）・細胞化学・血清学・フローサイトメトリーflow cytometryフローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー）・染色体/分子遺伝学を組み合わせて行う（10-2-immunoserology-methods-iの多発性骨髄腫multiple myeloma, MM多発性骨髄腫（multiple myeloma, MM）multiple myeloma, MM（多発性骨髄腫）症例も参照）。

⭐ EuroFlowパネルは形質細胞の悪性度を1回の測定で読み解く多色パネル。 検証された8色パネル（単管スクリーニングパネル＋多管分類パネル）として設計され、細胞集団を同定するバックボーンマーカーを全管で同じ蛍光色素 fluorescent dye 蛍光色素（fluorescent dye） fluorescent dye（蛍光色素） 位置に固定し、そこに特定集団を特徴づけるマーカーを組み合わせる⁴。CD138/CD27/CD38/CD56/CD45/CD19/CD117CD117（CD117 (c-KIT)）/CD81などを組み合わせ、骨髄腫細胞myeloma cell 骨髄腫細胞（myeloma cell）myeloma cell（骨髄腫細胞） に特徴的な表現型（CD19陰性・CD56強陽性・CD45陰性・CD138陽性など、正常形質細胞とは異なるパターン）を検出する。

B細胞分化段階のCDマーカーパネル

前駆B細胞precursor B cell 前駆B細胞（precursor B cell）precursor B cell（前駆B細胞） （Pro-B：CD34+CD19+TdT+）→前B細胞（Pre-B：CD10+ic CD22+）→未成熟B細胞→成熟B細胞→活性化B細胞→形質細胞という分化段階を、それぞれ特徴的なCDマーカーの組み合わせで識別できる（05-3-b-lymphocytes-and-the-humoral-immune-responseの発生段階 developmental stages 発生段階（developmental stages） developmental stages（発生段階） も参照）。骨髄内Intraosseous 骨髄内（Intraosseous）Intraosseous（骨髄内） は抗原非依存的、末梢では抗原依存的な分化が進む。

症例：HIV/AIDSにおけるCD4モニタリング

健常者ではリンパ球中のCD4+細胞は20〜40%を占める。14%未満は重度の免疫障害を示唆する——CDCCDC（Centers for Disease Control and Prevention）のAIDSAIDS（acquired immunodeficiency syndrome）サーベイランス定義 surveillance definition サーベイランス定義（surveillance definition） surveillance definition（サーベイランス定義） でも、CD4数200/µL未満と並んでCD4比率14%未満が基準に含まれている⁵。HIVHIV（human immunodeficiency virus）は主にCD4+ Th細胞に感染するため、CD4+/CD8+比の算出が重要——免疫不全症 immunodeficiency 免疫不全症（immunodeficiency） immunodeficiency（免疫不全症） 候群の患者ではCD4陽性T細胞数が減少する。フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） はこの定量的モニタリングに適している。

機能解析への応用

フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） はサイトカイン産生・細胞傷害活性cytotoxic activity細胞傷害活性（cytotoxic activity）cytotoxic activity（細胞傷害活性）・活性酸素中間体reactive oxygen intermediate (ROI) 活性酸素中間体（reactive oxygen intermediate (ROI)）reactive oxygen intermediate (ROI)（活性酸素中間体） 産生・シグナル伝達・貪食能phagocytic capacity貪食能（phagocytic capacity）phagocytic capacity（貪食能）・薬剤耐性antimicrobial resistance, AMR 薬剤耐性（antimicrobial resistance, AMR）antimicrobial resistance, AMR（薬剤耐性） といった細胞機能の解析にも使われる（校正proofreading 校正（proofreading）proofreading（校正） ビーズ・アイソタイプisotype アイソタイプ（isotype）isotype（アイソタイプ） 対照を併用）。

💡 単球のHLA-DR発現量は敗血症患者の予後を予測する。 高い単球HLA-DR発現は敗血症患者の良好な転帰を予測する——相対発現量だけでなく絶対発現量の経時的変化 serial change 経時的変化（serial change） serial change（経時的変化） （1回目・2回目の採血比較）を追うことに臨床的意義がある。サイトカインビーズアレイは、抗サイトカイン抗体を結合させたマイクロビーズと、蛍光標識fluorescent label 蛍光標識（fluorescent label）fluorescent label（蛍光標識） 抗サイトカイン抗体を組み合わせたサンドイッチ法 sandwich method (immunoassay) サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)） sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法） で、可溶性サイトカインを検出する。

まとめ

• フローサイトメトリーflow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry）flow cytometry（フローサイトメトリー） は1細胞ずつ多パラメータ Parameter パラメータ（Parameter） Parameter（パラメータ） で解析する高速検査法で、稀少細胞集団の検出に強い反面、高価で専門性を要する。
• FSC（サイズ）・SSC（顆粒度granularity顆粒度（granularity）granularity（顆粒度））の散乱光 scattered light 散乱光（scattered light） scattered light（散乱光） だけで白血球サブセットを大まかに区別でき、CD45/CD14などのゲーティング gating ゲーティング（gating） gating（ゲーティング） マーカーでさらに細胞集団を絞り込む。
• 免疫表現型検査immunophenotyping 免疫表現型検査（immunophenotyping）immunophenotyping（免疫表現型検査） は「発現の有無」「陽性率」「発現量」という3つの問いに答え、ヒストグラムのシフト（発現量の変化）とピーク高（陽性率の変化）は異なる意味をもつ。
• リンパ球サブセットパネルlymphocyte subpopulation panelリンパ球サブセットパネル（lymphocyte subpopulation panel）lymphocyte subpopulation panel（リンパ球サブセットパネル）・B細胞分化段階パネル・EuroFlow骨髄腫パネルなど、疾患特異的disease-specific 疾患特異的（disease-specific）disease-specific（疾患特異的） な多色パネルが臨床診断に応用される。
• HIV/AIDSのCD4モニタリング、敗血症の単球HLA-DR発現、サイトカインビーズアレイなど、定量的モニタリングと機能解析の両面でフローサイトメトリー flow cytometry フローサイトメトリー（flow cytometry） flow cytometry（フローサイトメトリー） は中心的な役割を果たす。