イムノアッセイ（手法 II）

🧠 免疫測定法immunoassay 免疫測定法（immunoassay）immunoassay（免疫測定法） は「検体の種類」で手法が決まる、と読む。 体液検体→ELISAELISA（enzyme-linked immunosorbent assay）・ラテラルフローlateral flowラテラルフロー（lateral flow）lateral flow（ラテラルフロー）・RIA/IRMA、単離タンパク検体→ウェスタンブロット Western blotウェスタンブロット（Western blot） Western blot（ウェスタンブロット）、固形組織検体 tissue specimen 組織検体（tissue specimen） tissue specimen（組織検体） →免疫組織化学 immunohistochemistry (IHC) 免疫組織化学（immunohistochemistry (IHC)） immunohistochemistry (IHC)（免疫組織化学） （免疫蛍光immunofluorescence, IF免疫蛍光（immunofluorescence, IF）immunofluorescence, IF（免疫蛍光））。いずれも抗原抗体反応 antigen-antibody reaction 抗原抗体反応（antigen-antibody reaction） antigen-antibody reaction（抗原抗体反応） という同じ土台の上に、検出方法（酵素発色・放射性標識・蛍光色素fluorescent dye蛍光色素（fluorescent dye）fluorescent dye（蛍光色素））だけが異なる。

診断法の統計学的特性

感度＝真の患者のうち検査陽性となる者の割合。特異度＝健常者のうち検査陰性となる者の割合。

ELISA（酵素結合免疫吸着測定法）— 3つの主要な型

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='enzyme-linked immunosorbent assay'>ELISA</span>の3型"]
  A --> B["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='indirect'>間接法</span><br>コーティング→洗浄→ブ<span class='jp-term jp-term-diagram' title='locking'>ロッキング</span>→検体中の1次抗体→2次抗体（<span class='jp-term jp-term-diagram' title='enzyme label'>酵素標識</span>）→発色基質"]
  A --> C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sandwich method (immunoassay)'>サンドイッチ法</span><br>捕捉抗体＋検出抗体で抗原を挟み込む"]
  A --> D["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='competitive'>競合法</span><br>抗原量と発色強度が<span class='jp-term jp-term-diagram' title='inverse correlation'>逆相関</span>"]

⭐ 競合ELISAは「発色が強いほど抗原が少ない」という直感に反する関係をもつ。 検体中に抗原が多いほど、標識抗原labeled antigen 標識抗原（labeled antigen）labeled antigen（標識抗原） と検体中の抗原が結合部位を奪い合い遊離抗体free antibody 遊離抗体（free antibody）free antibody（遊離抗体） が減少し発色は弱くなる。逆に抗原が少なければ遊離抗体 free antibody 遊離抗体（free antibody） free antibody（遊離抗体） が多く残り発色は強くなる——この逆相関 inverse correlation 逆相関（inverse correlation） inverse correlation（逆相関） 性により、可溶性抗原soluble antigen 可溶性抗原（soluble antigen）soluble antigen（可溶性抗原） の微量検出に特に有用。

⚠️ 方式が分かれば、干渉の「向き」まで予測できる——ビオチン biotin ビオチン（biotin） biotin（ビオチン） 干渉。 市販marketing 市販（marketing）marketing（市販） の免疫測定の多くはビオチン biotin ビオチン（biotin） biotin（ビオチン） 標識抗体とストレプトアビジン avidin アビジン（avidin） avidin（アビジン） の結合を設計に組み込んでいるため、サプリメントsupplement サプリメント（supplement）supplement（サプリメント） 等で血中ビオチン biotin ビオチン（biotin） biotin（ビオチン） が高濃度になると測定値が狂う。その向きは方式で決まっていて、競合法competitive assay 競合法（competitive assay）competitive assay（競合法） では偽高値 falsely elevated (value) 偽高値（falsely elevated (value)） falsely elevated (value)（偽高値） （正の干渉）、サンドイッチ法sandwich method (immunoassay) サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法） では偽低値 spuriously low value 偽低値（spuriously low value） spuriously low value（偽低値） （負の干渉）になる——遊離T3 free T3遊離T3（free T3） free T3（遊離T3）・遊離T4（競合法competitive assay競合法（competitive assay）competitive assay（競合法））が偽高値 falsely elevated (value)偽高値（falsely elevated (value)） falsely elevated (value)（偽高値）、TSH（サンドイッチ法sandwich method (immunoassay)サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法））が偽低値 spuriously low value 偽低値（spuriously low value） spuriously low value（偽低値） となり甲状腺機能亢進症と誤診 misdiagnosis 誤診（misdiagnosis） misdiagnosis（誤診） されるのが最も多い型である¹。交差反応cross-reactivity 交差反応（cross-reactivity）cross-reactivity（交差反応） 物質・異好抗体heterophile antibody異好抗体（heterophile antibody）heterophile antibody（異好抗体）・自己抗体・高濃度フック効果 hook effect フック効果（hook effect） hook effect（フック効果） と並ぶ、免疫測定の主要な干渉要因として整理しておく²。

ELISAの臨床応用（多岐にわたるパネル検査）

💡 感染症診断では「ウイルスそのもの」ではなく「ウイルスに対する抗体」を測ることが多い。 活性化B細胞が形質細胞へ分化し抗ウイルス性ポリクローナル抗体 polyclonal antibody ポリクローナル抗体（polyclonal antibody） polyclonal antibody（ポリクローナル抗体） を産生する——この抗体を体液から検出することが、ウイルス粒子virion ウイルス粒子（virion）virion（ウイルス粒子） を直接検出するよりも実務上の標準になっている。

結核診断とQuantiFERON試験

Th細胞・記憶T細胞memory T cell 記憶T細胞（memory T cell）memory T cell（記憶T細胞） がツベルクリン tuberculin ツベルクリン（tuberculin） tuberculin（ツベルクリン） 抗原刺激でIFN-γを産生する→ELISAでIFN-γを検出（QuantiFERON試験）。1mLの血液を3本のチューブ tube チューブ（tube） tube（チューブ） （結核抗原ペプチド3種）で刺激培養し、血漿中に放出されたIFN-γをELISAで測定——24時間以内に結果が出て、特別な検査室基盤を必要としない利点をもつ（07-3-hypersensitivity-ii-ivのツベルクリン反応 tuberculin reaction (Mantoux test) ツベルクリン反応（tuberculin reaction (Mantoux test)） tuberculin reaction (Mantoux test)（ツベルクリン反応） も参照）。

⭐ QuantiFERON試験の強みは特異度であって感度ではない——そして「活動性か潜在性 latent 潜在性（latent） latent（潜在性） か」は区別できない。 メタアナリシスmeta-analysis メタアナリシス（meta-analysis）meta-analysis（メタアナリシス） の統合値は、感度がQuantiFERON-TB Goldで78%（95%信頼区間73〜82%）、QuantiFERON-TB Gold In-Tubeで70%（63〜78%）、T-SPOT.TBで90%（86〜93%）と十分とは言えない一方、特異度はQuantiFERON両者ともBCGBCG（bacille Calmette-Guerin）未接種者で99%（98〜100%）、BCG接種者でも96%（94〜98%）——ツベルクリン反応 tuberculin reaction (Mantoux test) ツベルクリン反応（tuberculin reaction (Mantoux test)） tuberculin reaction (Mantoux test)（ツベルクリン反応） と違いBCG接種の影響を受けないのが最大の利点である³。裏返せば、陰性でも結核感染 TB infection 結核感染（TB infection） TB infection（結核感染） を否定できないし、陽性でも活動性結核 active tuberculosis 活動性結核（active tuberculosis） active tuberculosis（活動性結核） の診断にはならない。

症例：HIV診断（ELISA＋ウェスタンブロットによる確認）

35歳女性、一時的な交際相手が2人。HIV陽性か？陽性なら相手に感染させた可能性は？——間接ELISAで抗HIV IgG抗体を検出し、陽性例はウェスタンブロットWestern blot ウェスタンブロット（Western blot）Western blot（ウェスタンブロット） で確認するという2段階アルゴリズムをたどる。

⚠️ ただしウェスタンブロット Western blot ウェスタンブロット（Western blot） Western blot（ウェスタンブロット） による確認は、現在の標準アルゴリズムではない。 米国では2014年のCDCCDC（Centers for Disease Control and Prevention）/APHL検査アルゴリズムにより、第4世代HIV-1HIV-1（human immunodeficiency virus type 1）/2抗原抗体同時検査 antigen/antibody combination assay 抗原抗体同時検査（antigen/antibody combination assay） antigen/antibody combination assay（抗原抗体同時検査） でスクリーニング→反応性ならHIV-1/2抗体鑑別イムノアッセイ immunoassay イムノアッセイ（immunoassay） immunoassay（イムノアッセイ） →鑑別が陰性・判定保留equivocal 判定保留（equivocal）equivocal（判定保留） ならHIV-1 RNARNA（ribonucleic acid）核酸増幅検査 nucleic acid amplification test, NAAT核酸増幅検査（nucleic acid amplification test, NAAT） nucleic acid amplification test, NAAT（核酸増幅検査）という流れに置き換わっており、この第4世代検査を起点とするアルゴリズムのほうが急性感染の検出に優れる⁴。抗体しか見ない検査は、p24抗原が出てから抗体が立ち上がるまでの期間を取りこぼす。以下のウェスタンブロット Western blot ウェスタンブロット（Western blot） Western blot（ウェスタンブロット） の原理と判定基準は、手法の考え方として押さえる。

⚠️ ELISAの各ステップを飛ばすと、何が起こるかを推論できることが理解度を測る。 二次抗体（抗ヒトIg結合体）を洗い流さずに基質を加えれば、全ウェルが等しく強い発色を示してしまう（洗浄不足→非特異的シグナル）。逆に検体（患者血清）を加え忘れた場合、抗ヒトIg結合体は結合できず洗浄で除去されるため、発色は起こらない——「陰性に見えるが手技ミスによる偽陰性」を見抜く視点が重要。

ウェスタンブロット法

①タンパクをSDS-PAGE（ドデシルdodecyl ドデシル（dodecyl）dodecyl（ドデシル） 硫酸ナトリウム・ポリアクリルアミドゲル電気泳動SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGEポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE）SDS-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE（ポリアクリルアミドゲル電気泳動））でサイズ分離、②膜へ転写、③免疫検出（immunodetection：患者血清を1次抗体として、あらかじめ膜上に固定されたウイルスタンパクと反応させる）。

⭐ HIVウェスタンブロット Western blot ウェスタンブロット（Western blot） Western blot（ウェスタンブロット） の判定基準は「コアタンパクcore protein コアタンパク（core protein）core protein（コアタンパク） と外被タンパクの両方」を要求する。 バンドなし＝陰性。p31またはp24（コアタンパクcore proteinコアタンパク（core protein）core protein（コアタンパク））と、gp160またはgp120（外被糖タンパク）のバンドが同時に存在して初めて陽性——片方だけでは判定不能 indeterminate 判定不能（indeterminate） indeterminate（判定不能） というルールが、偽陽性を減らす仕組みになっている。

ラテラルフロー技術（迅速イムノクロマト法）

単一ステップの免疫クロマトグラフィー immune chromatography, IC 免疫クロマトグラフィー（immune chromatography, IC） immune chromatography, IC（免疫クロマトグラフィー） 検査（イムノクロマト法immunochromatographyイムノクロマト法（immunochromatography）immunochromatography（イムノクロマト法））は数分で結果が出る（従来法は数時間）、安価で検査室の専門知識を要さない。

応用例： HIV、モルヒネ（尿検査）、ヘリコバクター・ピロリHelicobacter pylori ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）Helicobacter pylori（ヘリコバクター・ピロリ） 抗体/便中抗原stool antigen便中抗原（stool antigen）stool antigen（便中抗原）、尿中hCG（妊娠検査）、ライム病病原体抗体、小麦粉のグルテン gluten グルテン（gluten） gluten（グルテン） 含量測定。

抗原検出型ラテラルフロー

flowchart TD
  A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='nasopharynx'>鼻咽頭</span>検体を溶解緩衝液に投入<br>ウイルスタンパクを細胞外に放出"]
  A --> B["抗Sタンパク抗体で被覆した着色微粒子と混合"]
  B --> C["検体中のS/N抗原が微粒子上の抗体に結合"]
  C --> D["テストラインの別エピトープ特異的抗体に捕捉 → 発色"]
  D --> E["コントロールライン（抗ヒトIg抗体）で手技の<span class='jp-term jp-term-diagram' title='validity'>妥当性</span>を確認"]

抗体検出型ラテラルフロー

病原体に対するIgM・IgG抗体を検出する。IgMは感染後平均7日、IgGは平均14日で出現する。

⚠️ IgM・IgG両方陰性でも「感染していない」とは言い切れない——ウィンドウ期 window period ウィンドウ期（window period） window period（ウィンドウ期） の罠。 IgM−/IgG−は抗体が検出限界 limit of detection 検出限界（limit of detection） limit of detection（検出限界） 以下なだけで、現在の感染を除外する根拠にはならない（ウィンドウ期window periodウィンドウ期（window period）window period（ウィンドウ期））。IgM+/IgG−またはIgM+/IgG+は現在の感染を示唆し、IgM−/IgG+は既感染を示唆する——この4パターンの解釈を誤ると、急性期の感染者を「陰性」と誤診 misdiagnosis 誤診（misdiagnosis） misdiagnosis（誤診） しかねない。

免疫放射定量法と放射免疫測定法

💡 測定法の感度は「下限検出限界 limit of detection検出限界（limit of detection） limit of detection（検出限界）」で比較でき、現在ではRIA/ELISAより質量分析法 mass spectrometry 質量分析法（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析法） の方が高感度になっている。 コルチゾール測定を例にとると、蛍光測定法（最も低感度）→酵素免疫測定法 enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 酵素免疫測定法（enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)） enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA)（酵素免疫測定法） →蛍光偏光 polarized light 偏光（polarized light） polarized light（偏光） 法/液体クロマトグラフィー chromatography クロマトグラフィー（chromatography） chromatography（クロマトグラフィー） →HPLCHPLC（high-performance liquid chromatography）→RIA→ELISA→同位体 isotope 同位体（isotope） isotope（同位体） 希釈GC-MSGC-MS（gas chromatography-mass spectrometry）→LC-MS/MS（最高感度）という順に検出限界 limit of detection 検出限界（limit of detection） limit of detection（検出限界） が向上する——放射性同位体 radioisotope (radioactive isotope) 放射性同位体（radioisotope (radioactive isotope)） radioisotope (radioactive isotope)（放射性同位体） を用いる古典的手法が、必ずしも最高感度とは限らない時代になっている。

免疫組織化学と免疫蛍光法

直接法direct IH 直接法（direct IH）direct IH（直接法） と間接法 indirect IH 間接法（indirect IH） indirect IH（間接法） があり、一般に組織切片 tissue section 組織切片（tissue section） tissue section（組織切片） 上の抗原を検出する（例：膵組織切片 tissue section 組織切片（tissue section） tissue section（組織切片） 上のインスリン分泌細胞 insulin-secreting cell インスリン分泌細胞（insulin-secreting cell） insulin-secreting cell（インスリン分泌細胞） の同定）。

⭐ 免疫蛍光法immunofluorescence assay (IFA) 免疫蛍光法（immunofluorescence assay (IFA)）immunofluorescence assay (IFA)（免疫蛍光法） では「抗原」が実は抗体そのものであることがある——自己抗体検出の逆説 paradox逆説（paradox） paradox（逆説）。 培養肝細胞上で患者血清中の抗RNP（核リボ核タンパク）自己抗体を検出する場合、検出対象（＝「抗原」的に扱われるもの）は患者自身の抗体である。ANAスクリーニング（間接蛍光抗体法indirect immunofluorescence assay (IFA)間接蛍光抗体法（indirect immunofluorescence assay (IFA)）indirect immunofluorescence assay (IFA)（間接蛍光抗体法）、08-3-screening-methods-for-autoantibodies参照）はまさにこの原理に基づく——1:40陽性・1:160で判定確定という力価判定と、その後のELISAパネル（SSA/SSB/Scl-70/Jo-1/Sm/RNP/ヒストン/dsDNA等）による特異抗体同定 antibody identification 抗体同定（antibody identification） antibody identification（抗体同定） が、実際の臨床検査レポートでも連動して運用されている。

検体別・手法まとめ

まとめ

• ELISAは間接法 indirect method間接法（indirect method） indirect method（間接法）・サンドイッチ法sandwich method (immunoassay)サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法）・競合法competitive assay 競合法（competitive assay）competitive assay（競合法） の3型があり、競合法competitive assay 競合法（competitive assay）competitive assay（競合法） は「抗原が多いほど発色が弱い」という逆相関 inverse correlation 逆相関（inverse correlation） inverse correlation（逆相関） 性ゆえに微量抗原の検出に向く。自己免疫・内分泌・腫瘍・感染症と極めて広範なパネル検査に応用される。
• HIV診断はELISA（スクリーニング）→ウェスタンブロット Western blot ウェスタンブロット（Western blot） Western blot（ウェスタンブロット） （確認、p24/p31＋gp120/gp160の同時陽性が判定基準）という2段階アルゴリズムをとり、手技ミス（洗浄不足・検体添加忘れ）の帰結を推論できることが理解の鍵。
• ラテラルフロー法lateral flow assay ラテラルフロー法（lateral flow assay）lateral flow assay（ラテラルフロー法） は数分で結果が出る迅速検査で、抗原検出（現在の感染）と抗体検出 antibody detection 抗体検出（antibody detection） antibody detection（抗体検出） （IgM/IgG、ウィンドウ期window period ウィンドウ期（window period）window period（ウィンドウ期） に注意）の2種類があり、後者は出現時期（IgM約7日、IgG約14日）を踏まえた解釈を要する。
• RIA（競合法competitive assay競合法（competitive assay）competitive assay（競合法）、抗原量とシグナル逆相関 inverse correlation逆相関（inverse correlation） inverse correlation（逆相関））とIRMA（サンドイッチ法sandwich method (immunoassay)サンドイッチ法（sandwich method (immunoassay)）sandwich method (immunoassay)（サンドイッチ法）、抗原量とシグナル正相関)は対照的な原理をもち、現在では質量分析法 mass spectrometry 質量分析法（mass spectrometry） mass spectrometry（質量分析法） がこれらを凌ぐ感度を実現している。
• 免疫組織化学immunohistochemistry (IHC)免疫組織化学（immunohistochemistry (IHC)）immunohistochemistry (IHC)（免疫組織化学）・免疫蛍光immunofluorescence, IF 免疫蛍光（immunofluorescence, IF）immunofluorescence, IF（免疫蛍光） は固形組織上の抗原（または自己抗体を「抗原」として扱う自己抗体検出）を検出し、ANAスクリーニングとELISA特異抗体パネルの連動運用はその臨床応用 clinical applications 臨床応用（clinical applications） clinical applications（臨床応用） の典型例。