滅菌の原理と実際、LAL試験

🧠 滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） のゴールはただ一つ、「芽胞を含むすべての微生物を殺す」こと。 熱・放射線・ガス・濾過のどれを選ぶかは、対象物が熱に耐えられるか、液体か、気体透過性かで自動的に決まる。そして芽胞よりもさらに厄介なプリオンprion, PrPプリオン（prion, PrP）prion, PrP（プリオン） は、通常の滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） 法が効かない例外中の例外として別枠で覚える。

滅菌とは

滅菌sterilization滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） とは、調製物中のすべての微生物（細菌芽胞bacterial spores細菌芽胞（bacterial spores）bacterial spores（細菌芽胞） を含む）を殺滅・除去する過程を指す。無菌 とは、処理された物品が生きた生物を一切含まない（germfree）状態を意味する。

💡 滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） は病原体を含むすべての微生物を死滅させる点で、病原性微生物のみを減らす消毒（1/11）とは区別される。

滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） が用いられる対象（無機物）：

• 医療機器medical devices医療機器（medical devices）medical devices（医療機器）・器材、医薬品、輸液、カテーテル、注射針——患者の安全のため
• 培養培地culture medium培養培地（culture medium）culture medium（培養培地）、検体容器、接種ループなど——検体の汚染を避けるため
• 感染性廃棄物の除去

滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） 法は大きく物理的方法と化学的方法に分けられる。

💡 「無菌」は0か1かではなく、確率で定義されている。 生き残る微生物が1個もいないことは原理的に証明できないため、工業的な滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） は滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） 保証水準（SAL、sterility assurance level）という確率で規定される。医療機器medical devices 医療機器（medical devices）medical devices（医療機器） では SAL 10⁻⁶——すなわち「滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） 後の製品1個あたり、生きた微生物が残っている確率が100万分の1以下」が標準的な目標で、エチレンオキサイドethylene oxide エチレンオキサイド（ethylene oxide）ethylene oxide（エチレンオキサイド） 滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） （ISO 11135）でも放射線滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） でもこの水準に合わせて条件が決められる¹。だから「オートクレーブを何分かければよいか」という問いには、対象物にどれだけ菌が付いているか（バイオバーbiovar バイオバー（biovar）biovar（バイオバー） デン）と、その菌の耐熱性 heat resistance (thermotolerance) 耐熱性（heat resistance (thermotolerance)） heat resistance (thermotolerance)（耐熱性） （D値）が絡む。

物理的滅菌法

熱

熱はタンパク質・核酸を不可逆的に変性させ、細胞膜の完全性 completeness 完全性（completeness） completeness（完全性） を破壊することで滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） する。

放射線

• γ線gamma radiationγ線（gamma radiation）gamma radiation（γ線）：電離放射線 ionizing radiation 電離放射線（ionizing radiation） ionizing radiation（電離放射線） で核酸を損傷する。通常は産業用途に限られる。
• 紫外線：手術室や検査室の空気中の微生物を殺滅する。

化学的滅菌法

• エチレンオキサイドガス滅菌ethylene oxide gas, ETO sterilisationエチレンオキサイドガス滅菌（ethylene oxide gas, ETO sterilisation）ethylene oxide gas, ETO sterilisation（エチレンオキサイドガス滅菌）：反応性の高いアルキル化剤 alkylating agents アルキル化剤（alkylating agents） alkylating agents（アルキル化剤） で、ヒトに対して毒性（発がん性carcinogenicity発がん性（carcinogenicity）carcinogenicity（発がん性））を持つ。低温で作用するが、最低48時間の換気を要する。実験室機器、部屋、プラスチックplastic プラスチック（plastic）plastic（プラスチック） 製器具、医薬品に使用。

• プラズマ滅菌plasma sterilisationプラズマ滅菌（plasma sterilisation）plasma sterilisation（プラズマ滅菌）：過酸化水素hydrogen peroxide過酸化水素（hydrogen peroxide）hydrogen peroxide（過酸化水素）（H2O2）蒸気を高周波 high frequency 高周波（high frequency） high frequency（高周波） またはマイクロ波 microwave マイクロ波（microwave） microwave（マイクロ波） によって低温プラズマ（物質の第4の状態＝電子が剥ぎ取られた荷電 charged 荷電（charged） charged（荷電） フリーラジカル free radicals フリーラジカル（free radicals） free radicals（フリーラジカル） の集合）に変換する方法。反応性の高いフリーラジカル free radicals フリーラジカル（free radicals） free radicals（フリーラジカル） が膜・ペプチド・DNADNA（deoxyribonucleic acid）などの高分子を破壊して微生物を殺滅する。過程の終わりには過酸化水素 hydrogen peroxide 過酸化水素（hydrogen peroxide） hydrogen peroxide（過酸化水素） が酸素と水に変換され、毒性残留物は残らない。金属・プラスチックplasticプラスチック（plastic）plastic（プラスチック）・熱に弱い材料に使用。プロトコル：30〜60℃、真空vacuum 真空（vacuum）vacuum（真空） 下で最低1時間。

• 液体薬剤/溶液：グルタルアルデヒド glutaraldehydeグルタルアルデヒド（glutaraldehyde） glutaraldehyde（グルタルアルデヒド）、ヨウ素、ヨウ化カリウムpotassium iodideヨウ化カリウム（potassium iodide）potassium iodide（ヨウ化カリウム）、ホルムアルデヒドformaldehydeホルムアルデヒド（formaldehyde）formaldehyde（ホルムアルデヒド）、過酢酸。

膜濾過法

• 大きさによる微生物の排除を利用し、熱に弱い液体の滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） に用いる。

• 汚染された溶液を膜濾過すると、細菌を含む微小粒子 droplet 微小粒子（droplet） droplet（微小粒子） が膜上に捕捉される。

• 膜は（ガラスフィルター barrier フィルター（barrier） barrier（フィルター） の代わりに）酢酸セルロース celluloseセルロース（cellulose） cellulose（セルロース）／硝酸nitric acid 硝酸（nitric acid）nitric acid（硝酸） セルロース celluloseセルロース（cellulose） cellulose（セルロース） で作られる。

• 孔径pore size 孔径（pore size）pore size（孔径） は0.1〜0.45 μmの範囲で調整可能。

滅菌法の選び方

flowchart TD
    A["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='sterilization'>滅菌</span>したい対象は？"] --> B{"熱に耐えられるか？"}
    B -->|"耐えられる（ガラス・金属など）"| C["<span class='jp-term jp-term-diagram' title='dry heat'>乾熱</span> or <span class='jp-term jp-term-diagram' title='moist heat'>湿熱</span>（オートクレーブ）"]
    B -->|"耐えられない"| D{"液体か<span class='jp-term jp-term-diagram' title='solid'>固体</span>・気体透過性材料か？"}
    D -->|"熱に弱い液体"| E["膜濾過（0.1〜0.45μm）"]
    D -->|"<span class='jp-term jp-term-diagram' title='plastic'>プラスチック</span>・機器・部屋など"| F["ETOガス or <span class='jp-term jp-term-diagram' title='plasma sterilisation'>プラズマ滅菌</span>"]

プリオンの不活化

• プリオンprion, PrPプリオン（prion, PrP）prion, PrP（プリオン） は誤って折りたたまれたタンパク質であり、中枢神経系の進行性変性を引き起こす。

• 伝播経路：脳神経外科 neurosurgery 脳神経外科（neurosurgery） neurosurgery（脳神経外科） 用器具、移植された硬膜、ヒト成長ホルモンgrowth hormone (GH)成長ホルモン（growth hormone (GH)）growth hormone (GH)（成長ホルモン） 製剤など。

• 熱による滅菌 sterilization滅菌（sterilization） sterilization（滅菌）、消毒薬disinfectant消毒薬（disinfectant）disinfectant（消毒薬）、酸性pHには一般に抵抗性を示す。

• アルカリ性（塩基性）pHにのみ感受性を持つ。

⚠️ プリオンの不活化elimination of prions プリオンの不活化（elimination of prions）elimination of prions（プリオンの不活化） には通常の滅菌 sterilization 滅菌（sterilization） sterilization（滅菌） プロトコルでは不十分であり、以下のような特別な条件が必要となる。

• オートクレーブ（＋1気圧、121℃、1時間）
• 5%次亜塩素酸塩 hypochlorite 次亜塩素酸塩（hypochlorite） hypochlorite（次亜塩素酸塩） 溶液
• 1.0 M 水酸化ナトリウムsodium hydroxide (NaOH)水酸化ナトリウム（sodium hydroxide (NaOH)）sodium hydroxide (NaOH)（水酸化ナトリウム）

💡 数値で押さえるなら「134℃・18分」が欧州で広く採られている条件である。 マウスを用いた定量実験では、134℃18分または121℃30分のオートクレーブ、および1N水酸化ナトリウム sodium hydroxide (NaOH) 水酸化ナトリウム（sodium hydroxide (NaOH)） sodium hydroxide (NaOH)（水酸化ナトリウム） 15分が、いずれもプリオン prion, PrP プリオン（prion, PrP） prion, PrP（プリオン） 感染性を10⁶分の1以下へ落とした。一方、グルタルアルデヒドglutaraldehyde グルタルアルデヒド（glutaraldehyde）glutaraldehyde（グルタルアルデヒド） や過酢酸といった液体消毒薬 disinfectant 消毒薬（disinfectant） disinfectant（消毒薬） は部分的な効果しか示さなかった²。通常のオートクレーブ条件（121℃・15〜20分、134℃・3分）ではまったく足りないことに注意する。なお「アルカリ性pHにのみ感受性」というのは覚え方としての要約で、実際には強アルカリ strong alkali強アルカリ（strong alkali） strong alkali（強アルカリ）・強酸化剤 oxidising agents 酸化剤（oxidising agents） oxidising agents（酸化剤） （次亜塩素酸塩hypochlorite次亜塩素酸塩（hypochlorite）hypochlorite（次亜塩素酸塩））・過酷な湿熱 moist heat 湿熱（moist heat） moist heat（湿熱） を組み合わせるのが実務上の原則である。

LAL試験

• LAL（Limulus amebocyte lysate、カブトガニhorseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab）horseshoe crab（カブトガニ） 変形細胞溶解 cytolysis 細胞溶解（cytolysis） cytolysis（細胞溶解） 物） は、カブトガニhorseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab）horseshoe crab（カブトガニ） の血球から得られる抽出物。

• LALはエンドトキシンendotoxin エンドトキシン（endotoxin）endotoxin（エンドトキシン） LPS（lipopolysaccharide）（グラム陰性菌の膜成分、1/4・1/27参照）と反応する。

• 医薬品中の発熱物質pyrogen発熱物質（pyrogen）pyrogen（発熱物質） の存在を検出するために用いられる。

• LAL試験：LPSの存在下でカブトガニ horseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab） horseshoe crab（カブトガニ） の血液が凝固する反応を利用する。

💡 LAL試験にはカブトガニ horseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab） horseshoe crab（カブトガニ） を使わない代替法がある。 LALの凝固カスケード coagulation cascade 凝固カスケード（coagulation cascade） coagulation cascade（凝固カスケード） の引き金となるファクターCを遺伝子組換えで作ったrFC（recombinant factor C、組換えファクターC）を使えば、カブトガニhorseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab）horseshoe crab（カブトガニ） の採血なしに同じ検出ができる。複雑な基材をもつヒト用ワクチン4製剤での比較では、rFC法はLAL法と少なくとも同等の成績を示し、動物実験animal testing 動物実験（animal testing）animal testing（動物実験） の3R（replacement 代替・reduction 削減・refinement 改善）に沿う点が利点とされた³。ただし収載状況には地域差があり、rFC法は欧州薬局方には収載された一方、2023年時点では米国薬局方（USP）の公定法にはなっていなかった⁴。カブトガニhorseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab）horseshoe crab（カブトガニ） の個体数減少という保全・動物福祉上の論点が、この置き換えを後押ししている。

まとめ

• 滅菌sterilization 滅菌（sterilization）sterilization（滅菌） は芽胞を含むすべての微生物の殺滅・除去であり、病原体のみを減らす消毒とは区別される。
• 物理的方法には熱（乾熱dry heat乾熱（dry heat）dry heat（乾熱）・湿熱moist heat湿熱（moist heat）moist heat（湿熱））と放射線（γ線gamma radiationγ線（gamma radiation）gamma radiation（γ線）・紫外線）があり、それぞれ対象物の耐熱性 heat resistance (thermotolerance) 耐熱性（heat resistance (thermotolerance)） heat resistance (thermotolerance)（耐熱性） で使い分ける。
• 化学的方法にはETOガス滅菌 sterilization滅菌（sterilization） sterilization（滅菌）・プラズマ滅菌plasma sterilisationプラズマ滅菌（plasma sterilisation）plasma sterilisation（プラズマ滅菌）・液体薬剤があり、熱に弱い器材や医薬品に用いる。
• 膜濾過は熱に弱い液体を孔径 pore size 孔径（pore size） pore size（孔径） 0.1〜0.45μmの膜で物理的に濾過する方法。
• プリオンprion, PrP プリオン（prion, PrP）prion, PrP（プリオン） は熱・消毒薬disinfectant消毒薬（disinfectant）disinfectant（消毒薬）・酸性pHに抵抗性で、アルカリ性pH（高濃度NaOHや次亜塩素酸塩 hypochlorite次亜塩素酸塩（hypochlorite） hypochlorite（次亜塩素酸塩）、あるいは通常より過酷なオートクレーブ条件）でのみ不活化できる例外的な対象である。
• LAL試験はカブトガニ horseshoe crab カブトガニ（horseshoe crab） horseshoe crab（カブトガニ） 血球抽出液がグラム陰性菌のLPS（エンドトキシンendotoxinエンドトキシン（endotoxin）endotoxin（エンドトキシン））と反応して凝固する性質を利用し、医薬品の発熱物質 pyrogen 発熱物質（pyrogen） pyrogen（発熱物質） 検出に用いられる。動物由来zoono- 動物由来（zoono-）zoono-（動物由来） 試薬を使わない組換えファクターC（rFC）法という代替法があり、薬局方への収載状況は地域で異なる。